实验技能 | 第四期：保姆级PCR实验，让你轻松上手！！！

营养师

作者：知乎


在实验室，我们经常看见“练习两年半”的师兄师姐们，在普通PCR仪、荧光定量PCR仪上“舞刀弄棒”，我们对这些现象既新鲜又好奇，却不知从何下手，今天我们就来学习一下PCR实验整体过程，让PCR实验、qPCR实验技能成为科研利器！在学习这期课程时，我非常建议：不熟悉这些实验的小伙伴回顾一下前几期核酸提取课程，这对于做PCR实验、qPCR实验有着非常重要的作用。正所谓：“万丈高楼平地起”，基础不打好，实验怎么做得好呢！这期内容分为三部分：PCR实验基础篇、PCR实验结果分析篇及PCR实验升级篇。
1.1 PCR反应
聚合酶链反应技术（Polymerase chain raction ,PCR）是一种在体外扩增特定DNA片段的方法，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，可用很短时间使目的基因或某一片段扩增十万乃至几百万倍。



诺贝尔奖得主：卡里·穆利斯（Kary Mullis）

1.2 PCR类型
1.2.1 常规PCR：直接PCR是指直接从样品扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。
1.2.2 热启动PCR：热启动PCR常用于增强PCR扩增的特异性。该方法主要利用抗体、亲合配体、适体或化学修饰物等酶修饰酶，来抑制室温下的DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR体系配制阶段引物与模板、引物与引物之前的结合能力降低，从而避免了非特异性扩增。



普通PCR仪器

1.2.3 巢式PCR： 巢式PCR是标准PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。
1.2.4 快速PCR：在快速PCR中，通过缩减PCR步骤所需时间来完成更快的扩增，且不会影响扩增产量和效率。快速循环条件尤其适用于具有高扩增能力的DNA聚合酶，这类聚合酶在每个结合中可引入更多的核苷酸。
1.2.5 高GC含量PCR：具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含GC的序列同时也涉及二级结构。因此，富含GC的序列可导致DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。
1.2.6 多重 PCR：多重PCR可在同一PCR反应管中同时扩增多个不同的片段。多种PCR不仅意味着节省时间、试剂和样品，还能够同时对比多个扩增子
1.2.7 长片段 PCR：长片段PCR通常是指扩增大于5kb的DNA片段。长片段PCR传统上使用 Taq DNA 聚合酶（用于快速延伸）和高保真酶（用于提高准确性）的混合物。
1.2.8 荧光定量PCR：序列的扩增程度（得率）取决于模板起始量，PCR常用于对样品中的DNA进行定量，其中，最常见的应用是 基因表达定量。



荧光定量PCR仪

1.3 PCR组成成分
1.3.1 模板NDA：来源比较广，几乎所有形式的DNA和RNA都能作为PCR反应的模板。模板DNA的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
1.3.2 缓冲液：用于维持DNA聚合酶的活性和稳定性。
1.3.3dNTP：四种dNTP是PCR原料，其比例和浓度与PCR密切相关。dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应用1M NaOH或1M Tris配成高浓度后，HCI的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200 μmol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。dNTP储存液：dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到10mol/L，分装后存放在-20℃冰箱中。dNTP使用浓度在20～200 μmol/L之间。4种dNTP必须等浓度配合以减少错配误差。
dNTP使用浓度：在PCR反应中，使用低dNTP浓度，可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。例如在100 μl的反应体系中，4种dNTP的浓度为20 μmol/L，可基本满足合成2.6 μg DNA或10 pmol/L的400bp序列。使用低dNTP浓度(每种dNTP浓度为2μmol/L),能够高度灵敏地(1/107)扩增ras基因点突变的等位基因。
1.3.4 Taq DNA聚合酶：目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化--典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100 ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。



Taq DNA聚合酶结构图

1.3.5 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
（1）引物长度：15-30bp，常用为20bp左右；
（2）引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段；
（3）引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸 的成串排列；
（4）避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；
（5）引物3’端的碱基，特别是最末端倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；
（6）引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；
（7）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；
（8）引物量：每条引物的浓度0.1～1μmol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
1.3.6 Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。


小结：引物是PCR特异性反应的关键，不好的引物严重影响实验的质量，好的引物可以事倍功半；酶的选择一般是看实验的目的，例如克隆长片段，可能就需要高保真的聚合酶；dNTP浓度和Mg2+浓度高了会影响PCR反应特异性。DNA模板中蛋白质也会严重影响PCR质量，因此上述6个基本成分质 量和浓度必须合理。
1.4 PCR反应实验基本原理
基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
（2）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
（3）引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
1.5 PCR反应实验所需物料
1.5.1 实验材料：模板DNA/cDNA
1.5.2 试剂：dNTP、Taq DNA聚合酶、蒸留水（ddH2O）、PCR缓冲液物、氯化镁1.5.3 耗材：PCR仪、移液枪、PCR板、0.2ml薄壁离心管、离心管盒
1.6 实验步骤
1.6.1 引物设计：后面将会有一期着重介绍。
1.6.2 模板制备：可回顾前3期核酸提取介绍。
1.6.3 标准的PCR反应体系以GenStar 2×SuperTaq 预混液（染料）为例：


1.6.4 PCR反应条件控制
（1）PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。
（2）镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。
（3）底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 μmol/L。
（4）TaqDNA聚合酶2.5U(100 μl）。
（5）引物浓度一般为0.1 ～0.5 μmol/L。
（6）反应温度
a. 变性温度和时间95℃，30s。
b. 退火温度和时间 低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃。
c. 延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。
d. Tm值=4(G+C) +2(A+T)
（7）循环次数：一般为25～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
1.7 PCR反应的循环参数


（1）预变性（Initial denaturation）：模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
（2）循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
（3）引物退火（Primer annealing）：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
（4）引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp
（5）循环数大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。
（6）最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
1.8 PCR反应程序


（1）DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。
（2）退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
（3）延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
1.9 PCR检测
1.9.1 琼脂糖凝胶电泳
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。取10 ul 扩增产物用1％~2%琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
1.9.2 荧光定量PCR（探针法）由于电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。
1.10 PCR反应常见问题
Q1：假阴性，不出现扩增条带


（1）模板原因
a. 模板中含有杂蛋白质。
b. 模板中含有Taq酶抑制剂。
c. 模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。
d. 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
e. 模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活
a. 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。
b. 忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物
a. 引物质量。
b. 引物的浓度。
c. 两条引物的浓度是否对称。
解决对策：
a.  选定一个好的引物合成单位。
b. 引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
c. 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
d. 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度
a. 浓度过高降低PCR扩增的特异性。
b. 浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
（5）反应体积的改变
a. 通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定;
b. 在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（6）物理原因
a. 变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性。
b. 退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
c. 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度有问题。
（7）靶序列变异
a. 靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合。
b. 靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。
Q2: 假阳性，出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。


（1）引物设计不合适
a. 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。
b. 靶序列太短或引物太短。
（2）靶序列或扩增产物的交叉污染
a. 整个基因组或大片段的交叉污染。
解决方案：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
b. 空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。
解决方案：可用巢式PCR方法来减轻或消除。
Q3: 出现非特异性扩增：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
（1）  引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体。
（2） Mg2+离子浓度过高。
（3） 退火温度过低。
（4） PCR循环次数 过多有关。
（5） 酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。降低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
Q4: 出现片状拖带或涂抹带


（1）原因
a. 酶量过多。
b. 酶的质量差。
c. dNTP浓度过高。
d. Mg2+浓度过高。
e. 退火温度过低。
f. 循环次数过多引起。
（2）对策
a. 减少酶量。
b. 调换另一来源的酶。
c. 减少dNTP的浓度。
d. 适当降低Mg2+浓度。
e. 增加模板量。
f. 减少循环次数。

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