实验室细胞污染常见类型及解决方案

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对于养细胞的人来说，可谓是谈「污」色变，每次养细胞总让人有种神经错乱，一进细胞房就想让空气都静止下来，打开培养皿的一瞬间，连呼吸都变得如此多余。只要有任何异样，无论是支原体还是杂菌，污染！污染！污染！犹如细胞实验的魔咒，让一切都无限重复……

今天MDL科研助手盘点了细胞污染常见类型及解决方案，一篇在手，以后你就能与细胞愉快的玩耍了！细胞污染一般分为细菌污染、真菌污染、支原体感染、黑胶虫污染。

01

细菌污染

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细菌污染最为常见，一旦操作稍有不当，就会引起细胞污染，细菌污染后显微镜下观察呈现有黑色细条沙状，当然，根据感染的细菌不同，所呈现的状态也不尽相同，有球形、杆状等，其次，培养液发黄，变浑浊，可明显看见培养皿中有细沙状的沉淀物，时不时还有异样气味发出，如下图所示：

葡萄球菌污染

解决方案：

在培养基中加入抗生素处理，可以用四环素，庆大霉素，或者链霉素，前两者的工作浓度是50μg/mL；链霉素的工作浓度是100 μg/mL。但是，细胞本身也有影响，状态大不如从前，所以，防范于未然，正确操作、严格执行无菌操作规范，定期清理消毒培养设施才是关键!

02

真菌污染

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表现：真菌的种类很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不变混浊。

倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝，并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长。

有时通过显微镜可能会发现在培养瓶外壁生长的菌丝，较易误认为污染。发现瓶外的菌丝后应及时用酒精擦拭干净。

霉菌污染

解决方案：

赶紧扔掉，不要再想挽救，即使再珍贵。然后彻底消毒灭菌培养间，CO2孵箱，器皿和培养液。

03

支原体污染

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支原体直径约为 0.1-0.3 μm，具有变形能力，可透过常见过滤膜（0.22-0.45 μm），因此常规的无菌过滤方法不能将其去除，常用的抗生素也对支原体无效。培养条件没变，又没有明显的污染迹象（浑浊、pH等），而细胞生长突然变慢、状态变差、细胞边界变得模糊；更换新的培养液，细胞状态没有恢复，细胞形态异常（拉丝、铺展）。

注：支原体污染时细胞表现为长得不好，也不死亡，同时，培养基又是清亮的，时间长达一周也没有什么变化，这时基本上可以判断出是支原体污染了。

可见细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点，其形状各异，与细胞共同被染成不规则的点状物，说明细胞被支原体污染

解决方案：

1）对于非重要的细胞，如培养中的细胞、WCB的细胞等，将培养物与用过的培养基灭活后丢弃即可。对于较为重要的细胞，如来源珍贵或实验室中细胞保藏量较小等可以采用以下（2）-（8）的方法。

2）用MRA处理：用支原体清除剂处理细胞，作用浓度为 25μg/ml，两周可以清除支原体。

3）用清洗纯化法清除支原体污染的方法：细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤，其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

4）药物辅助加温处理：先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

5）使用支原体特异性血清：用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

6）动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

7）巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止。

8）使用支原体清除培养基，每2~3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞1~2次；期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要用胰酶消化），并更换新的培养器皿，3天之后，即可见明显清除效果；处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全；如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天；为避免细胞再次受到“支原体”的污染，以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

04

黑胶虫污染

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“黑胶虫”是一种常见的细胞污染物，与细胞共生，随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，对细胞生长不利，严重时导至细胞死亡。目前很多细胞存在被“黑胶虫”污染的现象，对细胞培养及其后续实验造成了极大地影响。

“黑胶虫”污染的细胞常见的特性有以下几点：

• 培养基不浑浊，但在显微镜下观察细胞时，细胞周围和培养液中有很多“小黑点”， 且随着培养时间的延长“小黑点”逐渐增多，更换培养液或洗涤细胞不能将其去除；
• “黑胶虫”污染的细胞，营养消耗快，需要频繁更换培养液；
• “黑胶虫”污染的细胞生长缓慢，细胞状态差，空泡化严重，甚至还可能导至细胞形态的改变。
  
  

解决方案

对于黑胶虫污染的细胞，最为快速有效的处理方式就是采用黑胶虫清除剂对黑胶虫进行清除，同时确保培养体系中的血清必须为无黑胶虫和原虫污染的优质血清。