蛋白表达FAQ常见问题解析

xiaoqin

原核表达（这里是指 大肠杆菌表达系统 ）是目前常用的重组蛋白表达方式之一，操作相对简便，要求较低。相对哺乳动物表达系统更加经济节约。但是也常常遇到一些问题，比如原核表达蛋白表达量低？蛋白不表达？蛋白表达不在上清易形成包涵体等情况。本文主要根据实验经验总结 原核蛋白表达 的两个问题蛋白为什么不表达和蛋白表达为什么不在上清，并提出针对性的解决方案，帮助我们提高实验的成功率。原核表达FAQ主要内容如下：

一、蛋白表达为什么不在上清？

蛋白在大肠杆菌中的表达部位：细胞质中、细胞周质中、细胞外。

蛋白在细胞周质中表达：细胞周质是指革兰氏阴性菌中、位于内膜和外膜之间的结构部分。周质中表达的蛋白质，分离纯化简单，而且周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，但是蛋白产量很低。

蛋白在胞外表达：胞外分泌是使大肠杆菌中的外源蛋白分泌到培养基中。

途径：

①用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌的蛋白直接分泌到胞外培养基中。大肠杆菌在正常情况下只有极少的蛋白可以分泌到胞外，且不是特别有效。

②诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，从而使细胞内的蛋白向胞外培养基中分泌。

二、蛋白的分泌表达优点

1、一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白质分泌到周质或培养基中可增加其稳定性；

2、有些在细胞内表达时无活性的蛋白分泌表达时能够按适当的方式进行准确折叠，增加到蛋白的活性；

3、 由于蛋白质信号肽和编码序列间被切割，所以分泌蛋白产物不含氨基酸起始密码子ATG所编码的甲硫氨酸，而甲硫氨酸会影响许多蛋白的活性。

三、如何提高蛋白的可溶性？

重组蛋白在大肠杆菌中大量表达时，很容易在胞内形成不可溶的包涵体，为后期的纯化、复性带来麻烦，而且复性所得到的蛋白活性很低甚至没有活性。因此，提高重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达是十分必要的。

四、蛋白为什么不表达？

真核基因在原核细胞中的的特点

①使用原核启动子

原核细胞RNA聚合酶能识别真核基因启动子。

②真核基因要置于原核载体SD序列后

从真核DNA转录的mRNA缺乏结合原核核糖体的SD序列，不能启动翻译过程。

③使用cDNA

真核基因中含有内含子，而原核细胞缺乏转录后加工体系，mRNA中内含子不能切除，不能形成成熟的mRNA，也就不能表达真核蛋白。

④表达无需糖基化等修饰的蛋白

原核细胞缺乏真核细胞所特有的蛋白翻译后的修饰系统，不利于表达需要糖基化、磷酸化修饰才有活性的真核蛋白。

⑤真核基因必须切除信号肽序列

蛋白具有信号肽序列的真核基因在真核细胞内先表达成蛋白前体，在其穿越细胞膜向外分泌时，会被细胞膜上信号肽识别序列切除而分泌到细胞外。但是在原核细胞内表达时，不但影响蛋白的表达，同时由于大肠杆菌缺乏加工处理体系，不能正确切除信号肽，而表达的分泌蛋白的前体没有实物活性，常聚集在胞内。

五、影响原核表达的因素

1、翻译起始位点

现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行了优化，一般情况下不需要自己再添加，不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子。

2、GC含量

表达序列中的GC含量超过70%的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。

3、mRNA二级结构

在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。

4、密码子的偏爱性

如果外源基因密码子的使用频率和宿主菌高效表达的基因密码子的使用频率差异较大，翻译时核糖体在稀有密码子处就会产生停顿，这不仅降低蛋白质的合成效率，导至新生肽链的错误折叠而影响延伸，甚至会停止翻译。

5、质粒载体的选择

构建质粒载体时，要考虑质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码子，融合标签，复制子，筛选标记基因等因素。

6、基因或者蛋白的大小

一般来说小于10kd和大于100kd的蛋白都是难以表达的。

7、外源基因对宿主有毒性

外源基因在宿主内会抑制宿主菌的生长甚至导至宿主死亡，表观的现象：宿主菌在诱导后菌体量上升缓慢或不在生长。

8、基因突变（移筐突变）

碱基的突变、插入或缺失对阅读框的影响，可能会导至表达的蛋白质结构改变，或蛋白质合成过早终止。

9、培养诱导条件

培养基成分（C/N）及培养条件（温度、诱导时机、诱导剂，浓度、诱导时间）也是影响蛋白表达的。

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