液体活检“正当年”

长长的路

液体活检

liquid biopsy

液体活检（liquid biopsy），作为体外诊断的一个分支，是指通过检验血液或者其他体液如尿液、唾液、胸腔积液、脑脊液等，对癌症等疾病做出分析诊断。包括循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、microRNA、微泡（外泌体），甚至血小板等多项技术[1]（图1）。其中CTC与ctDNA发展最为迅猛。目前液体活检主要应用领域是肿瘤的血液检测，即利用血液提示肿瘤发展进程及抗药性等信息，指导个体化精准治疗［2］。

液体活检的优势

液体活检之所以受到高度关注，是因为在癌症的诊断和治疗过程中传统的组织活检技术所固有的局限性（主要表现为肿瘤的异质性），主要包括以下几个方面：

• 对于癌细胞已经发生转移的患者而言，仅仅取某个部位的肿瘤组织，并不能反映患者的整体情况，但而对所有的肿瘤组织都取样检测又不切实际；
• 某些患者自身的情况决定了他不适合做组织活检；
• 受到手术的扰动之后，有些肿瘤有加速转移的风险；
• 组织活检的滞后性对患者的治疗也是不利的。
  
  

液体活检受到关注的另一个原因在于，肿瘤的进展情况与生存期密切相关；对于多数肿瘤种类，早期发现可以达到90％以上的存活率，而晚期发现的肿瘤患者五年生存期仅为15%（表1），而传统的组织活检一般只能检测晚期肿瘤。而液体活检技术的出现，在理论上能够解决了上述问题，能够更全面、更便捷地进行肿瘤检测，并且可以实现动态监测和早期筛查。这也是液体活检技术被《麻省理工学院科技评论》评选为“2015年十大突破技术”的原因［3］(图1）。

表1  肿瘤患者五年生存期对比

简单的说，与传统的肿瘤检测方法相比，液体活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出显着的优势，应用发展潜力巨大。

图1  液体活检的分类与广阔前景

溯源CTC

液体活检虽然是近年来刚刚兴起的概念，然而CTC的历史却很源远流长。1869年，澳大利亚病理学家约翰·阿什沃思（John Ashworth）首次发现CTC，他在死去的肿瘤患者的尸检中发现了循环肿瘤细胞，并且推测其对于肿瘤本身具有影响：“在血液中发现的这些癌细胞对于患者至关重要……有一件事可以确认，它们（CTC）沿着循环系统而迁移”［4］。1960年科学家发现了多个CTC聚集在一起的CTC簇。而随着1994年Cellsearch系统的研发成功，大量的临床实验展现了CTC在癌症预后复发效用上的应用。包括乳腺癌、头颈癌、肝癌、结直肠癌等多项临床研究均证实CTC与癌症的不良预后相关［5］［6］［7］。

因此，CTC作为一种肿瘤生物标志物被写入美国癌症联合委员会（AJCC）肿瘤分期指南。在2014年，体外培养CTC得以实现。随着单细胞测序技术的进展，对于CTC单细胞测序的研究也大量开展，2016年的一个重要进展即是利用单细胞CTC多重转录组来研究肿瘤异质性的工作［8］［9］。

常用液体活检优势对比

CTC、ctDNA和外泌体是现在最为主流的液体活检技术，下表对三种技术做了简单的归纳（表2）。

在1 ml血液中，CTC的个数从个位数到上千不等。而ctDNA则约有0.8 ng，外泌体因为是小型囊泡，可以达到几千的数量。从技术门槛上来说，随着新一代测序技术的进步，ctDNA检测变得最为容易，也是液体活检领域发展最快的分支。而外泌体因为表面标志物和体积等本身性质原因，分离最为困难。CTC因为包含整个细胞的基因组、转录组、蛋白质组，并且可以进行全基因组测序（NGS）、miRNA、mRNA表达、突变检测等多项检测一直是液体活检领域在临床研究最为深入的（图2）。

经过美国食品与药物管理局（FDA）认证的可以直接应用于临床的液体活检技术在CTC里有三项，在ctDNA有肺癌的EGFR突变检测一项。而对于肿瘤早期检测的可能，大家都持乐观的态度，但是有更多的技术门槛需要跨越。对于CTC来说，作为液体活检领域临床研究最为深入使用的技术，目前已经有了一些早期监测的临床证据；而对于ctDNA来说，早期检测必然要面临超高测序深度和区分假阳性的问题；外泌体作为一个新兴领域，同样在早期检测上也引来了越来越多的关注。

表2  液体活检分类

图2  CTC与其他技术手段在癌症筛查中的对比

液体活检的临床应用

液体活检可以应用在肿瘤诊断和治疗的多个领域（图3）。包括：

• 癌症诊断：如果肿瘤在早期被诊断出，患者则可以开展治愈性手术，使治疗程序更快启动，增加患者的治愈率、生存率，延长患者的存活期。对于单体的患者，高敏感性和特异性的癌症检测可以促进治疗；在整个患者群体水平，液体活检作为新型疾病标志物可以在癌前病变阶段干预症状，攻克癌症［10］。
• 预后和复发风险评估：癌症进展风险的评估对于治疗手段的选择至关重要。在阶段性治疗后，采用液体活检鉴定（CTC或ctDNA监测）将患者分层，对高复发风险的患者进行辅助治疗。有效的患者分层同时可以避免低风险患者的过度治疗。
  
• 治疗方案筛选：在肿瘤治疗领域，新型分子靶向药物和免疫治疗剂发展迅猛。而其中一个重要工作即需要利用有效工具对患者进行分子谱／细胞谱分析和治疗分层。而因为肿瘤的异质性的原因，液体活检是一个更强大的工具来介入到患者药物的筛选上。
  
• 监测疾病负担：治疗监测（传统上使用影像学或分子生物学方法）可以反应治疗的效果或进展，使临床医生和患者能够看到治疗结果。传统的方法准确性较低，并且有费用昂贵和辐射问题。而理想的临床监测测定应当满足：
  1）易于连续重复；
  2）对患者风险小；
  3）可以提供准确的肿瘤负荷读数。
  
  

液体活检在这一领域有着无与伦比的优势［11］。

图3  液体活检技术的可应用范围

CTC临床应用案例

2016年CTC在临床领域的应用有很多成功的案例。例如罗马第一大学的一个研究组发现基于CTC的PD-L1检测对于免疫检查点抑制剂药物PD-1/PD-L1的临床用药具有指导作用。［12］在他们的研究中，对参与PD-1/PD-L1抑制剂治疗的二十四名IV期非小细胞肺癌患者，分析监测循环肿瘤细胞（CTC）的数目和CTC上PD-L1表达。结果在基线和治疗3个月时，发现CTC及其PD-L1的表达与患者不良反应的结果相关。治疗后6个月所有患者中都发现CTC，其中 PD-L1阴性CTC的患者都获得好的治疗效果，而PD-L1阳性CTC的患者疾病都进展了。从而阐明PD-L1（+）CTC可能成为抗PD-1定向治疗的预测性生物标志物。

另一个非常好的例子来自曼彻斯特大学Dive研究组，她们采用CTC（循环肿瘤细胞）的方法成功预测了肺癌的化疗耐药性。［13］该研究先是从13名小细胞肺癌患者中分离出的88个CTC上检测拷贝数畸变（CNA），基于CTC的CNA产生一个分类器。而后科学家在18名患者身上测试这一分类器，在对这18个患者身上112个CTC和6个患者CTC来源的衍生肿瘤外植体（CDX）进行测试后，发现分类器的准确度达到83.3%。因而开发出了基于CTC的生物标志物，判断出患者是否化疗敏感／耐受的新方法。该研究最直接的意义是：首次，在化疗之前，利用生物标志物CTC预测了患者的化疗敏感性。这一工作是具有历史开创性意义的，我们可以按照这一研究思路为小细胞肺癌以及其他癌症的患者，进行更为精确的分子／细胞分类，对于临床实验的患者分层，充分体现精准医学与4P医学（预测性、预防性、个体性、参与性）的价值。

而对于CTC应用于早癌筛查我们同样可以举出很多例子，例如来自麻省总医院（MGH）癌症中心的Daniel A. Haber团队2016年发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上的CTC在肝癌早期诊断的最新进展［8］。他们将CTC-iChip技术与基于RNA的数字PCR技术结合在一起，对肝癌病人血液中的CTC进行检测。CTC侵袭性地进入血液中，高通量微流控芯片CTC-iChip可有效地富集含有保存良好RNA的CTC。而基于RNA的数字PCR能够在血液样本中检测CTC的衍生标签，从而进行高度精确的基于组织谱系的癌症检测。数字RNA定量构成敏感和特异的CTC读数，使得能够进行高通量临床应用，例如在病毒性肝炎和肝硬化普遍存在的人群中无创筛选肝细胞癌。而用于癌症监测的CTC的数字评分系统同样广泛适用于其他癌症类型。许多癌症起源于异常表达的正常血细胞中不存在的特异性基因转录物，针对这些标记物的检测可以对血液中稀有癌细胞的进行高灵敏度检测和监测。这种基于血液的CTC分子监测对于癌症的早期检测具有相当大的意义。

CTC作为许多癌症预后评估的工具已经被FDA承认近十年。随着最近在包括体外和体内CTC异质性和CTC扩增的技术方面的进展，以及更新的单细胞分子分析，CTC领域提供了对癌症扩散和对治疗反应的生物学的独特见解。2016年发表的多项研究已经表明液体活检可以成功监测患者的预后状况，同时液体活检可以提供肿瘤分期的新依据。结合CTC / CTM和ctDNA方法对于扩展液体活检的临床效用具有相当大的希望。通过纵向测量CTC或ctDNA，监测化疗或其他靶向治疗的疗效是可行的［14］。基于CTC和ctDNA及其分子表征的治疗分层的研究已经启动。液体活检将成为精准医学中的重点。液体活检，正当年！

Reference

1,Alix-Panabières, C. and Pantel, K., 2013. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clinical chemistry, 59(1), pp.110-118.

2，Karachaliou, N., Mayo-de-las-Casas, C., Molina-Vila, M.A. and Rosell, R., 2015. Real-time liquid biopsies become a reality in cancer treatment. Annals of translational medicine, 3(3).

3, 10 Breakthrough Technologies 2015, MIT technologies Review

4，Ashworth, T.R., 1869. A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death. Aust Med J, 14(3), pp.146-149.

5，Rack, B., Schindlbeck, C., Jückstock, J., Andergassen, U., Hepp, P., Zwingers, T., Friedl, T.W., Lorenz, R., Tesch, H., Fasching, P.A. and Fehm, T., 2014. Circulating tumor cells predict survival in early average-to-high risk breast cancer patients. Journal of the National Cancer Institute, 106(5), p.dju066.

6，Gröbe, A., Blessmann, M., Hanken, H., Friedrich, R.E., Schön, G., Wikner, J., Effenberger, K.E., Kluwe, L., Heiland, M., Pantel, K. and Riethdorf, S., 2014. Prognostic relevance of circulating tumor cells in blood and disseminated tumor cells in bone marrow of patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity. Clinical Cancer Research, 20(2), pp.425-433.

7，Yokobori, T., Iinuma, H., Shimamura, T., Imoto, S., Sugimachi, K., Ishii, H., Iwatsuki, M., Ota, D., Ohkuma, M., Iwaya, T. and Nishida, N., 2013. Plastin3 is a novel marker for circulating tumor cells undergoing the epithelial–mesenchymal transition and is associated with colorectal cancer prognosis. Cancer research, 73(7), pp.2059-2069.

8，Kalinich, M., Bhan, I., Kwan, T.T., Miyamoto, D.T., Javaid, S., LiCausi, J.A., Milner, J.D., Hong, X., Goyal, L., Sil, S. and Choz, M., 2017. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences, p.201617032.

9，Gorges, T.M., Kuske, A., Röck, K., Mauermann, O., Müller, V., Peine, S., Verpoort, K., Novosadova, V., Kubista, M., Riethdorf, S. and Pantel, K., 2016. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clinical Chemistry, 62(11), pp.1504-1515.

10，Aravanis, A.M., Lee, M. and Klausner, R.D., 2017. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell, 168(4), pp.571-574.

11，Wan, J.C., Massie, C., Garcia-Corbacho, J., Mouliere, F., Brenton, J.D., Caldas, C., Pacey, S., Baird, R. and Rosenfeld, N., 2017. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nature Reviews Cancer.

12，Nicolazzo, C., Raimondi, C., Mancini, M., Caponnetto, S., Gradilone, A., Gandini, O., Mastromartino, M., Del Bene, G., Prete, A., Longo, F. and Cortesi, E., 2016. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific reports, 6.

13，Carter, L., Rothwell, D.G., Mesquita, B., Smowton, C., Leong, H.S., Fernandez-Gutierrez, F., Li, Y., Burt, D.J., Antonello, J., Morrow, C.J. and Hodgkinson, C.L., 2016. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nature Medicine.

14，Dive, C. and Brady, G., 2017. SnapShot: Circulating Tumor Cells. Cell, 168(4), pp.742-742.

来源：中国医学论坛报今日肿瘤  作者：胡志远 马琳 李妲 （国家纳米科学中心）