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[分享] 图说鲜肉IHC/ICC晋级攻略

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发表于 2017-1-13 22:26:26 | 显示全部楼层 |阅读模式

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西土有一名寺,昂迪·赛司腾姆寺,有大师。

一日,来了一位东土小鲜肉。

鲜肉问大师:“学业有惑,可解?”

大师反问:“你术业可是生物?”

鲜肉惊奇:“是,大师神奇,何以得知?”

大师指鲜肉鞋履:“鞋上两块蓝斑,乃考马斯亮蓝,其渍尚新,你近来必在捣弄蛋白,对否?”

鲜肉羞赧:“正是近日检测蛋白,跑胶无数,不慎滴上。现已斩获Western阳性结果一组,然不知课题如何进一步深入。”

大师欣然:“体外数据方为首步,须继之以体内定位,方法比如免疫组织化学/免疫细胞化学,西土称为IHC/ICC。”

鲜肉:“在下尚无相关历练,听人言IHC/ICC并非易事,不知决窍何在?”

大师眉间一抹豪气:“确有决窍,我已将其制成一帖,习之可使鲜肉秒变大师!”

言毕,大师取出一帖,交于鲜肉:“你我有缘,今赠帖于你,助你早日修成正果,技高一筹,Paper无忧。”

鲜肉喜出望外,接过这帖,叩谢大师,旋即翻开读了起来:

【方法学】

IHC/ICC利用抗原抗体相互作用来定位检测抗原表达,始于1970s,因方法成熟、结果直观而长盛不衰。根据样本类型和显色方式,组合成下图的四个流派。


各流派只在样品准备等步骤略有不同,后续介绍就以最流行的IHC(石蜡切片显色法)为例。

【操作流】

IHC流程包括二甲苯脱蜡,梯度乙醇复水,抗原修复,内源性过氧化物酶失活,非特异性物质封闭,抗体孵育,DAB显色这几步,中间的三步是关键。


【优化点】

流程中的三个关键步骤各有优化诀窍:

抗原修复

IHC特有步骤,因甲醛固定组织会造成目标表位内部或表位与附近无关氨基酸的交联、表位构象或电荷的改变,这可能导至目标表位被掩盖,阻碍抗体的结合。

抗原修复指的是恢复表位-抗体结合的技术。分蛋白酶诱导的表位修复(PIER)和热诱导的表位修复(HIER)。

一般认为PIER作用机制是切割了可能遮盖表位的肽段。其缺点在于成功率低,且可能破坏组织形态和目标抗原。

HIER被认为能逆转一些交联,并实现表位二级或三级结构的重建。HIER的成功率比PIER要高得多。

HIER对时间(1-10min)、温度(95-99℃)、缓冲液和pH敏感,要根据经验或通过预实验确定。抗原修复液中性(货号CTS015)、碱性(货号CTS013)和酸性(货号CTS014)三种。我们发现通常碱性抗原修复液的处理效果较好(如下图)。


内源性过氧化物酶失活

显色法常用辣根过氧化物酶(HRP)。在肾、肝或含有血管(包含红细胞)等组织都有内源性的过氧化物酶活性,会造成假阳性,用3% H2O2配制的试剂浸泡10min可将其失活。


封闭:防止非特异性染色

和Western Blot一样,IHC也要使用封闭试剂减非特异性染色,封闭针对三种作用:

对于非特导性疏水相互作用,用热灭活的正常血清、BSA、脱脂奶粉或者非离子去垢剂如0.3% Triton X-100或Tween 20封闭。


对于非特异性离子相互作用,若离子强度过低,非特异性离子相互作用增加,会导至高背景。单克隆抗体由于其单表位特异性,比多克隆抗体更易受低离子强度的影响。

对于内源性生物素的干扰,IHC经常用到链霉亲和素与生物素,而许多组织如肝、肾、心、脑和肺都含有内源生物素,这时孵育一抗前必须先封闭内源性生物素。常规方法是用亲和素孵育封闭内源性生物素,之后必须再加生物素封闭亲和素分子上未结合的生物素结合位点。

【胜负手】

决定IHC成败的关键,是一抗的选择和优化,一抗要能高效识别抗原的立体表位,同时特异性要好,以降低背景。选购前要确认抗体是否经过严格的IHC实验验证,由于IHC识别的是的立体表位,像Western这种线性表位下的验证结果是不算数的。R&D Systems公司生产抗体时采用活性重组蛋白做免疫原,筛选得到的IHC/ICC一抗可以特异性识别立体表位,亲和力高。产品的每一批次都在严格的质量控制体系下通过IHC/ICC实验验证,具有优秀的批间一致性,是研究者获得可靠IHC/ICC结果的保障。

优化方面,一抗浓度、稀释液、孵育时间和温度都影响染色效果,经常需要针对每个抗体和样品来优化。为确保抗体的完全渗透,组织切片的一抗孵育一般在4℃过夜。R&D Systems 的单抗建议浓度5-25ug/mL,多抗由于识别多个表位,受蛋白构象变化影响小,所需浓度较低,建议浓度为1.7-15ug/mL。

需要IHC/ICC相关试剂,可参考下表,让实验事半功倍。


【跳出经验帖,回到故事】

“少年!”大师拍了下看得入神的鲜肉,“既已赠帖与你,收藏了去慢慢看就是,我这还有一事。”

鲜肉收好帖子:“科研竞争激烈,故需争分夺秒。大师何事?”

大师另取一请柬,递向鲜肉:“本寺正有IHC/ICC比武大会,邀我前去担纲评委,请你随我一同前往,品评一下。


来源:R&D Systems
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