液体活检：惠及众生的江河蓝海，还是野蛮失控的蓝藻池？

长长的路

►液体活检的简要流程，图片来自http://inivata.com

编者按：
        1869年，澳洲医生在肿瘤患者的血液中观察到脱落的肿瘤细胞，一百年后，研究者发现了捕获这些游离细胞的磁珠，并意识到它们在肿瘤早筛、辅助诊断、术后随访、疗效评估、耐药监测等方面潜在的巨大临床和科研价值。液体活检领域随之兴起，并被MIT Technology Review杂志以及ASCO(美国临床肿瘤学会)评为突破性技术，一时间液体活检风起云涌，资本会把池塘变成惠及患者的江河蓝海，还是野蛮失控生长的商战蓝藻池？

一百年前，爱因斯坦凭借着超人的洞察力提出广义相对论并预言引力波的存在，却难以提供证实方法。随着科技飞速发展，汇集了全球顶尖科学家的LIGO（Laser Interferometer Gravitational-Wave Observatory）团队在90年代初即开始建立激光干涉波观测站，终于用激光编织的巨网、经由干涉波纹的微量变化倾听到来自宇宙深处不同方向的引力波。同样的百年故事也发生在一批埋首于人体幽微细小处的医学家中。1869年，澳洲医生Ashworth从一例转移性肿瘤患者血液中观察到从实体瘤脱落入血的肿瘤细胞，把它命名为循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs），为其后Paget的“种子土壤学说”提供了重要依据。直至1983年，人类才发现了能够捕获CTC的磁珠。历经20年，CTC检测系统Cell search正式获得美国FDA批准用于转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌临床检测；近30年后的2012年，Cell Search系统获得CFDA进口器械注册。敏锐学者开始意识到液体活检在肿瘤早筛、辅助诊断、术后随访、疗效评估、耐药监测等潜在的巨大临床和科研价值。   
进入2015，基因测序行业元年，国家卫计委一系列政策利好。风乍起，吹皱一池春水，起于青萍之末。风起的池塘，液体活检在资本护持下风起云涌，会把池塘变成惠及患者的江河蓝海，还是野蛮失控生长的商战蓝藻池？


液体活检前生今世
2015年，MIT Technology Review发布的年度十大突破技术（Breakthrough Technologies 2015） 、ASCO年度进展（Clinical cancer advance 2015）对未来十年的期许，液体活检均榜上有名。


►肿瘤组织的细胞脱落，会进入血液系统中，通过捕获这些游离的肿瘤细胞或DNA片断，我们可判断肿瘤的分子分型，从而对症下药。图片来自http://medicalxpress.com


目前液体活检主要通过血液、尿液甚至唾液等的标本、检测包括游离循环肿瘤细胞、肿瘤DNA、小分子RNA及长链非编码RNA等协助癌症诊断。与目前标准的组织活检相比，革命性的液体活检具有一些理论优势：创伤小、可重复性、均化异质性、实时判断疗效，并随肿瘤的发展而动态调整治疗决策。

由于检测手段的局限性及循环肿瘤细胞的极低频，长期以来液体活检并未发挥实质性的作用。从发现CTCs至今的一百多年里，科学家像一支不知疲倦的侦察奇兵，即便只是肿瘤细胞路过的遗落信息甚至死亡的残骸，也要探寻出变异密码。这就是目前液体活检技术的两个主要方向：CTC和ctDNA。

虽然Cell Search系统已在临床上广泛应用，并被美国国家医保Medicare所认可。但该系统属于第一代CTC技术，其缺点在于假阴性率高和难以深度分析。Cell Search系统目前只能计算CTC的数量，不能对单个CTC进行包括基因测序、蛋白表达、药物敏感性检测等更细致的分析。以肺癌为例，由于大部分肺癌细胞迁移入血的过程中容易出现上皮间质转化，丢失上皮表面粘附分子的表达。而上皮粘附分子又是Cell Search系统主要的捕获靶标。因此，Cell Search在肺癌中的CTC检测结果并不尽如人意。为了克服上述缺点，提高CTC检出的灵敏度和发展对捕获和富集CTC细胞进行后续分析的能力，在研的二代CTC检测采用了多种技术路线。但无论是在技术还是市场方面均处于早期阶段，尚没有统一的标准，目前还很难判断哪一种技术路线将成为行业标准。

另一方面，ctDNA检测也成为临床探索的热点。由于肿瘤特异性的ctDNA并不存在于正常细胞中，他们为癌症检测提供了一种十分敏感和特异的方法，临床应用的可行性甚至超越CTCs。但是在循环肿瘤标志物中，ctDNA与CTC因其来源不同、评价标准不同、生物学特征不同，两者可能侧重于不同方面的临床应用。CTC在精确反映肿瘤细胞血循环微转移中具有显著优势，可以有效评估肿瘤的发生发展状态，因此在早期筛查、辅助诊断、复发监测及疗效评估上具有独特地位。而ctDNA则更侧重于反应肿瘤细胞内DNA的变异情况，因此其在治疗决策（驱动基因检测）及靶向耐药监测中发挥重要作用。从技术角度，同时检测CTC与ctDNA技术上可行，从临床角度，同时检测CTC和ctDNA所得到的信息可能是互补的。两种液态活检技术共存可能是未来的发展方向。总的来说，保证特异性前提下的高敏感度、便于临床应用、可重复性好是CTC与ctDNA检测技术的三个重要评判标准。


蓝海：来日之可期
敏感的投资者们早已捕捉到这一风向标，海内外液体活检市场加速崛起。JP摩根和高盛将液体活检细分为早期筛查、诊断分型、药物伴随检测、患者病情监测4个领域，预测市场潜力将达千亿级。这个乐观预测的基础源于大数据提供的时代背景和市场容量。基因测序应用领域的下一个爆发点将是肿瘤市场。随着测序技术的进步、样本的积累，肿瘤领域的基因测序市场将加速发展。我国正面临着降低癌症发病率和提高癌症生存率的双重挑战，存量肿瘤患者中，适合使用液体活检技术的肿瘤病人至少为542万人，占比72%。该技术在未来5年至10年的市场渗透率将达50%。

技术的进步则为投资者的乐观氛围锦上添花。回归到肺癌的诊疗上，液体活检技术已渗透到肺癌的精准治疗中：以外周血ct DNA/CTC为材料，进行EGFR突变和ALK融合等治疗驱动性靶点检测；在EGFR-TKIs用药期间，动态监测血浆EGFR敏感突变的定量变化预测患者疗效；在EGFR-TKIs耐药患者中，检测血浆耐药基因T790M的浓度以制定后续治疗策略。可以说，液体活检为肺癌的靶向治疗建立了实时、动态、定量的驱动基因检测体系，与精准医学的思路契合，潜能巨大。技术领先的公司如Cynvenio、Biocept、Adaptive Biotechnologies等已经获得了美国FDA第三方诊断实验室的认可，也显示出监管机构对液体活检技术临床价值的认可。与此同时，中国CFDA 也批准首个肺癌循环肿瘤细胞检测（靶向 PCR CTC）技术正式应用于临床，将有效应用于早期肺部小结节或者团块影患者的辅助诊断、手术后复发监测和晚期患者化疗疗效评估。

乐观预期下，资本对液体活检表现出格外青睐。以Illumina公司为例，融资1亿美元成立新公司Grail，致力于开发“滴血验癌”的早筛试剂盒。获得8000万美元融资成立的Codiak  BioSciences，竟是以当年6月份在《自然》杂志上发表的成果为基础。新技术从学科刊物到实体经济转化速度仅几个月时间，让人咋舌。

不过，争相进入蓝海的热潮里也有冷静声音。技术进步与医保覆盖将是接下来打入这个市场最大“鸡血”，但恰好这两项也是目前最大的制约。由于我国地域广阔，区域间的医疗水平差异很大，医保经费紧张，短期内是不太可能覆盖这种新的检测技术。另外，海内外投资机构也认为，该技术还处于早期阶段，从技术成熟到最终实现其市场潜力还需要5-15年时间。


蓝藻：未来尚未来
池塘生春草，园柳变鸣禽。本是春意盎然好时节，但若池塘内是随风潜入夜、悄然野蛮生的蓝藻，将带来生态链的隐忧甚至灾难。蓝藻在铺满水塘前8天，仅占池塘的1/256，细微到无法觉察。然而，8天时间，1/128、1/64、1/32、1/16的指数扩张，它已悄然间占领整个池塘。对于风生水起的液体活检，学界与投资界各怀“蓝藻之忧”。2015年9月10日，加州公司Pathway Genomics在新闻发布会宣布推出Cancer Intercept TM ——首个用于高危人群癌症筛查的液体活检试剂盒。然而短短10天后，Pathway即遭到美国FDA的警告。在此之后，FDA还叫停了另一家硅谷公司Theranos的疾病滴血检测服务。
缘何吸引眼球的新技术未能得到监管部门的肯定？在肯定液体活检重要意义的同时，我们也应该看到，新技术在真正步入高级别临床证据支持前尚面临诸多挑战。这也是“蓝藻之忧”的第一个层面：在技术尚未完善和标准化之前，野蛮生长的产业也许会带来区域性的失控。

第一，技术层面。基于CTC和ctDNA的驱动基因检测无论在检测技术或基因的动态变化层面均存在众多挑战。首先，外周血EGFR突变检测具有高的特异性，但敏感性徘徊于50%~70%左右，是外周血检测临床应用的瓶颈；其次，目前的研究尚未明确EGFR-TKIs治疗过程中敏感和耐药基因的动态变化规律；最后，CTC的分选匮乏兼具高敏感性和特异性的ct DNA/CTC驱动基因分析技术。

同样，目前也没有通用的ctDNA特征用于任何阶段或类型的癌症筛查。首先，增加检出灵敏性的同时也增加了基因杂音的干扰，从而导至了假阳性的增加；其次，不是所有的癌症都与离散的和一致的早期基因突变有关，很多癌症在疾病的任何阶段以意想不到的方式产生多种突变；此外，不是所有的肿瘤都会以相同的方式向血液中释放ctDNA；最后，任何新的诊断检测必须经历临床验证，这是常规获批的必要步骤。

第二，医学伦理层面。尚不成熟的技术推向市场带给大众的是恐慌多于福祉。近年来，肺癌的流行病学谱已发生了迁移，不吸烟、年轻、女性患者比例逐年增高。原来单纯以年龄和吸烟状态作为危险因素定义的依据远远不够。其次是如何取得早筛和过度诊断治疗的平衡。如果我们穷尽各种检测手段，仍然没有发现可见肿瘤，是否需要对这部分人群进行后续的随访复查？筛查本身的并发症，患者的精神忧虑和经济负担又如何衡量？

尽管风险重重，诱人前景仍让投资者对液体活检爱不释手。“若不赶紧跑马圈地，不知不觉之间池塘就会被蓝藻占领，再无空间”，这也成为另一种“蓝藻之忧”。回报越高的领域，风险也越高。据MIT商业评论报道，Foundation Medicine为了开发体液活检已经花掉了近2亿美元，现在仍在以每季度数百万美元的速度消耗；其次，2013年美国最高法院规定基因作为一种自然存在的事物，不能被申请专利；现在这一规定已经延伸到了体液活检。巨额的投入，研发的风险，最后也许是失去了专利的保护，给企业提出了更高的挑战。此时，只有研发出最合理的检测手段和运营策略，才能成为行业的佼佼者。技术仍然成为整个领域里最大的掣肘，同时也是最大的催化剂。


规范与精准同行
在此，我们必须对FDA的警告拍手称赞。对于临床研究者而言，液体活检这一新技术既是机遇也是风险，需要扶持和宽容，更需要符合伦理、合理引导、限定范围和有效监管。我们需要在科学性和商业性、创新实践和规则制约之间寻找平衡。对前景不明朗的研究方向，研究热情靠什么支撑下去？ 是兴趣，以探索未知的好奇心；是合作，来自不同的专业背景的共赢，促进新技术的良性循环。


参考文献
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原文出自《循证医学》杂志第16卷第 1期
钟文昭、雷源源、吴一龙 （广东省肺癌研究所，广东省人民医院）