肿瘤分子诊断的发展趋势 & 投资方向

检验医师

2016年，美国临床肿瘤协会（ASCO）报告指出癌症对人类的威胁日益严重，预计到2030年，全球被诊断的癌症患者将达到2200万。而中国的人口老龄化加之空气污染、食品卫生、吸烟、膳食结构问题的存在，将会导至癌症的发病率急剧增高。

随着分子生物学的发展，特别是基因测序效率的大幅度提升，肿瘤分子诊断逐渐成为肿瘤诊断发展的重要方向。美国临床肿瘤协会（ASCO）年度报告中对未来10年的发展做了前瞻，认为有5个方向是未来肿瘤防治的关键：肿瘤干细胞研究和干预，更快捷、更廉价、更先进的基因组学技术，液体活检，纳米药物和医疗IT技术。其中，基因组学、液体活检和肿瘤的分子诊断相关。基因组学，尤其是新一代测序技术，以及液体活检目前已成为肿瘤领域诊断的热点和将来发展的重要方向。

基因测序

1．第三代测序将是大势所趋，但未来几年内商业应用主流仍是第二代测序

从1975年第一代的Sanger基因测序技术发展至今，目前已经进展到第三代，第二代的基因测序技术依然是目前市场主流。从2007年到2016年，第二代测序的市场增速达50%，预计在将来相当长的时间内仍将保持20%左右的增长。

第三代测序是未来的大势所趋，但是预计在将来5～10年内，第二、第三代基因测序会共存，但第二代测序仍会是测序市场商业应用主流。目前，国际上第三代测序主要公司有Oxford Nanopore和Pacific Bioscience，主流的应用技术为纳米孔和SMRT。和第二代测序相比，第三代测序目前最大的问题是错误率较高，达到了15%~40%。这也是限制第三代测序商用最关键的原因。

笔者认为，第三代测序将来的应用价值将重点体现在液体活检方向。对于ctDNA检测而言，由于ctDNA含量非常低，第三代测序技术灵敏度高，能够做到1ng以下监测；而对于CTC而言，第三代测序将有希望直接在单细胞级别对原始DNA原位测序。

2．中国目前基因测序产业格局：上游寡头、中游洗牌、下游待教育

从中国目前产业格局来讲，上游的仪器、试剂耗材销售领域形成国外四巨头垄断格局。国内厂家正在积极寻求突破，例如华大基因、贝瑞和康、达安基因等生产的测序仪已经获得CFDA（国家食品药品监督管理局）的批准。与此同时，国内的厂家在试剂耗材方面也有所进展，也主要集中在上述三家。中游测序服务由于进入门槛低，目前是鱼龙混杂，对测序数据的解读能力普遍不足，目前处于洗牌阶段，预计未来会倒掉一批公司，并逐步涌现出一些比较优秀的企业，形成自己的品牌。根据笔者不完全统计，在国内的8个主要城市，基因测序公司有多达159家。需要重点提到的是，对于测序数据的分析和解读将是测序公司近期突围的关键，核心的技术能力在于完善的数据库模型建立、临床结果结合分析解读能力等，预计将来有优秀的分析和解读能力的测序公司（或者专业从事基因测序数据分析和解读的公司）才能创造比较好的利润。对于只能测序不能解读的基因测序公司，如果市场布局完善，同时和专业数据分析解读公司建立良好的策略合作，也有一定的生存空间，但是利润空间会受到较大挤压。

从下游角度而言，肿瘤市场规模巨大，预计可达120亿。但是下游市场仍然处于一个待教育的过程，不管是医生、病人还是普通消费者，基因测序对他们而言，还是一个比较模糊的概念，对基因测序所带来的治疗等价值更加不清晰。

3．中国基因测序市场投资逻辑

目前，国内外对于测序公司的投资仍是热点。2015年，国外仅统计到的10家公司融资额即达到5亿美金，国内统计的10家公司融资额即超过了5亿人民币。根据不完全统计，专业从事测序服务的公司多达159家，从投资的角度来看，面对市面上众多的基因测序公司，如何判断该公司是否具有投资价值，是否能在众多的测序服务公司中突围，是一个头疼的问题。就投资方而言，关注第三代测序技术是投资的趋势，尽管目前第三代技术存在准确度比较低、通量低、成本高、分析软件不成熟的情况，但是由于其在液体活检领域的潜在价值，未来，如果三代测序能降低错误率、降低成本，它的商用空间会非常巨大。另外，对具有完善的数据库模型以及临床解读分析能力的测序公司或者数据分析公司可以重点关注，对于专注于一个独特领域的公司，例如发明肠道微生物技术定量检测技术LinEnrich的量化健康类似公司也可以适当关注。正如前面提到的，如果已经完成市场布局，形成完善的客户覆盖，或者能和优秀的数据分析解读形成策略性合作或并购类的公司，也是比较好的投资标的。

液体活检

1. 循环肿瘤细胞CTCs

CTCs是最早的液体活检标记物，也被认为是真正“完整”的液体活检标记物，但是因为检测技术难度较大，所以争议很多，进展也比较慢。

CTCs来自于抗凝的外周血全血，是完整的肿瘤细胞，来源于肿瘤原发灶/转移灶。因为是活细胞，富集后一般不宜长期保存。根据检测指标，CTC的临床应用可以分为四类：单个CTC的数量、CTC的型别（细胞学形态和结构分析）、CTC细胞蛋白质标志物分析、CTC的基因信息。这些信息可以用于病情评价和预后判断，指导个体化治疗，但还对于肿瘤早期诊断潜力不明确。

● CTC富集方法、效率和纯度有待提升，实现细胞的精准刻画远不成熟。

对于CTC而言，临床应用必须实现两个步骤，第一步是有效富集纯化具有活性的CTC细胞，第二步是对于富集的细胞进行进一步分析。由于每毫升血液中仅有1～10个CTC细胞，因此对细胞富集的效率就要求很高。随着技术的发展，从原来的物理学方法，到纳米磁珠结合微流控（CTC-Chip）的技术，再发展到了非磁性纳米磁珠结合微流控（HP-Chip）技术。2013年，出现了第三代的惯性聚焦技术（CTC-iChip），现在又出现了高通量涡旋芯片技术（Vortex HT），捕获效率83%，与非对称流分离系统和CTC-iChip相比，效率稍低但Vortex HT实验结果中白细胞污染较少，同时对样本量要求也相对较小。根据目前技术进展和商业转化的情况来看，第二代及第二代以上CTC技术尚处于早期阶段，没有统一的标准，许多公司采用不同的技术路线捕获细胞，目前还很难判断哪一种细胞捕获技术将成为行业标准。

需要提到的是，目前唯一得到FDA批准的CTC捕获技术是强生公司的CellSearch，但是CellSearch仅能计数，无法实现活细胞捕获并进行后续基因检测以及用药指导等要求。对CTC细胞的分子特性（例如药物靶向基因的表达，药物耐受相关基因突变的检测）的精细刻画，将有利于充分发掘CTC在指导临床治疗的价值。所以CellSearch在临床应用中受到了很大的限制。2016年初，强生的CellSearch在中国停止销售。

● 第三代测序的成熟，将会大大推动CTC的商业应用

如何有效实现对CTC细胞的精细刻画？从基因的角度来看，由于一个CTC细胞的DNA只有6.6pg，因此提升捕获效率、纯度和单细胞测序将是两个重要方向。因此，进一步提升CTC富集效率和利用新的技术进行单细胞基因测序将至关重要。三代测序是有希望实现CTC单细胞测序的最有前景的技术。

目前，在国际上CTC技术领先的公司有Biocept、Janssen Diagnostics、Qiagen、Epic Sciences、CytoTrack等，国内尚未观察到技术特别突出的公司。

2．循环肿瘤DNA（ctDNA）

ctDNA是片段化的肿瘤DNA片段，主要来自于抗凝血外周血的血浆，通常是指肿瘤细胞凋亡/坏死后释放的DNA片段。提取纯化后的ctDNA，可以保存，一般用于DNA突变监测、甲基化等DNA修饰相关分析，用于个体化治疗，肿瘤早期诊断潜力相对明确。

● 临床验证进展迅速，技术发展相对成熟，第三代测序的成熟将助力ctDNA发展

尽管ctDNA起步比CTC晚，但是近些年来研究进展迅速，尤其是结合第二代测序技术，加之较大规模的临床验证，让ctDNA的商业化应用变得可能。2016年的ASCO年会有一个ctDNA有史以来最大规模的临床案例，这个案例共纳入了15191例病人，结果发现血液标本的基因检测与既往的全球肿瘤基因组测序计划公布的各大肿瘤的突变情况相比较，吻合率高达92%~99%。

ctDNA的检测技术发展较快，目前的主流检测平台是第二代测序和ddPCR。比较新的技术有CAPP-Seq，主要是靶向捕获结合二代测序技术，也是目前国内外公司应用比较多的技术。关于ctDNA检测，国外有代表性的公司有Genomic Health、Guardant Health、Personal Genome Diagnostics、Pathway Genomics等，国内代表性公司有贝瑞和康、南京世和、燃石生物等。三代测序由于灵敏度高，只需要1ng以下DNA就可以实现测序，相信也是未来ctDNA应用的重要方向。

正是基于商业化的相对成熟，2016年6月，美国医疗保险机构Palmetto宣布已将体细胞变异ctDNA分析测试纳入其保险范围。

● 基于目前的情况，ctDNA在临床应用中仍然面临一些挑战

但是，ctDNA仍然面临着一些挑战，例如，高灵敏度的定点检测无法发现肿瘤演化过程中出现的新突变，而高通量的第二代测序的由于灵敏度远低于定点检测，因此目前仍局限于晚期肿瘤临床应用中；ctDNA来源的复杂性，使得其在不同疾病、不同肿瘤患者个体间差异性较大，这种机制上的不确定性，使得我们对ctDNA数据的解读应更加谨慎；ctDNA的变化，可能不能实时反映发生在肿瘤细胞中一些不依赖于基因组变异的信号通路的变化，例如转录调控，蛋白翻译后调控，或者表观遗传学调控等。

3. CTC和ctDNA孰优孰劣

最后，关于CTC和ctDNA孰优孰劣，一直存在争论。由于CTC特异性高，是完整的有活性的肿瘤细胞个体，能检测对药物的反应，可以提供新的肿瘤治疗靶点，可以帮助理解肿瘤转移的机制。但是CTCs检测难度大，只能代表肿瘤细胞的部分亚群，尽管反向选择的CTCs检测适用于大多数癌症种类，但有些癌症检出率太低。ctDNA含量较丰富，检测方法简便，可以用于实时监测乳腺癌等疾病的进展和疗效，灵敏度更高，但是特异性低，且不含特异性突变。ctDNA不适用于某些癌症的检测，比如肾癌。综上所述，CTC和ctDNA是相互补充的，有机的结合才是未来的方向。

4．液体活检的投资逻辑

由于第二代及第二代以上CTC富集技术尚处于早期阶段，没有统一的标准，许多公司不同的技术路线捕获细胞，目前还很难判断哪一种细胞捕获技术将成为行业标准，建议观望。从目前检测CTC方面来看，CTC肿瘤标志物免疫荧光检测是目前国外应用较多的技术，预计将来单细胞测序的实现将推动CTC的发展，现在来看，等待并关注第三代测序技术是较好的策略。

基于目前ctDNA相对成熟且临床证据较丰富的情况，可以积极参与投资，目前的检测平台一般为第二代基因测序与数字化PCR，靶向捕获+二代测序将是一个方向，另外第三代测序也是重要方向。

文/曹锋（华医资本合伙人，曾任法国赛诺菲、美国礼来、美国GE、美国艾尔建和日本卫材等世界500强公司高管，有近20年医疗行业经验）