男性不育的分子和遗传检测技术

检验医师

目前临床开展的男性不育分子和遗传检测技术主要包括染色体分析、Y染色体微缺失检测、基因突变筛查以及精子的相关检查。

1．染色体分析：

　　男性不育症患者中有5%存在染色体异常，包括染色体结构和数量的异常，其中15%为无精症患者。随着辅助生殖技术的发展，携带有遗传性异常的男性不育患者，已可以通过卵胞浆内单精子显微注射术/体外授精术/植入前遗传学诊断生育后代，而准确分型和诊断对选择辅助生殖方案至关重要。

　　常规的核型分析仍是染色体分析的重要手段，可检出染色体数目异常以及大于4 000 000 bp的染色体结构异常，如平衡/不平衡易位、倒位及显微镜下可见的大片段缺失和重复等。染色体的细微缺陷，如染色体微缺失和重排及基因组拷贝数量变化，则需要更精细的技术才能检出。近年来，荧光原位杂交、比较基因组杂交、微阵列比较基因组杂交等技术的发展和广泛应用，使得染色体分析的分辨率及检测的阳性率和准确性大大提高。

2．Y染色体微缺失检测：

　　Y染色体长臂无精子症因子(azoospermia factor, AZF)区微缺失引起的生精障碍是导至男性不育的重要原因，表现为原发性无精子症或少精子症。目前将AZF区分为AZFa、AZFb、AZFc 3个区域，各区域内包括若干AZF候选基因并主导精子形成过程中的不同阶段，它们的缺失或突变可能导至精子发生障碍，引起少精子症或无精子症。目前常用的检测方法有多重PCR法、实时荧光PCR法、基因芯片法等。

　　多重PCR法检测AZF区域不同的序列标签位点是目前Y染色体微缺失检测应用最广泛的方法。该方法操作简单、成本低廉，是欧洲男科学协会/欧洲分子遗传实验质控网推荐的方法。实时荧光PCR法自动化程度高，与传统PCR方法相比可缩短检测时间，并能避免EB等有毒核酸染料的污染。近年来发展起来的多重荧光定量PCR克服了实时荧光PCR每管只能检测1个位点的缺点，实现了高通量和高分辨率检测，因而更具应用性。基因芯片法是近十几年来发展起来的新技术，与多重定性PCR法相比，灵敏度和特异性都有所提高，并且具有高通量、微量化、自动化、集成化、快速等优点。近年来液态芯片技术，即多功能悬浮点阵技术(multi–analyte suspension assay，MASA)融合了PCR的高灵敏性、杂交技术的高特异性和光谱技术的高精确性等特点，无需电泳检测，克服了常规PCR技术的诸多缺陷[7]。由于杂交过程在悬浮溶液中进行，与固态芯片相比，检测速度加快、结果更稳定、成本更低，发展前景广阔。

3．男性不育相关基因检测：

　　涉及男性不育的基因突变包括X–连锁基因突变和常染色体基因突变。X–连锁基因突变的病例较少见，且其致病机制尚不完全清楚。X染色体相关的突变主要发生在KAL1基因和雄激素受体(androgen receptor，AR)基因，前者导至卡尔曼综合征(Kallmann syndrome)，表现为独立的性腺机能减退，不育及嗅觉缺失；而后者导至不同程度的雄激素不敏感，其表型也各不相同。有2%～3%的无精和严重少精男性存在AR基因突变。

　　尽管许多常染色体基因都被认为与男性生殖功能相关，但只有极少数的基因突变被明确证实有临床意义，如：囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)基因，胰岛素样因子3(insulin–like factor 3，INSL3)基因[11]和松弛素家族肽受体2(relaxin family peptide receptor，RXFP2)基因。CFTR在一般人群中的突变率较高，在西方国家的受试者中有1/25为该基因突变的携带者。因此，国际指南经常建议在进行辅助生殖之前，双方都应进行CFTR基因筛查]。

4．精子DNA的完整性和碎片分析：

　　
　　精子DNA的完整性对于精子功能和胚胎发育至关重要。如果卵细胞与DNA损伤的精子结合，可能导至囊胚发育异常、着床失败或自然流产。精子DNA损伤包括不同的形式，如精子染色质包装缺陷、凋亡、氧化应激、DNA片段化、基因突变和非整倍体。精子DNA的完整性可以通过下列实验进行检测：吖啶橙染色试验、精子染色质结构分析、彗星试验、精子染色质扩散实验、末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记试验、γH2A检测和原位缺口翻译法等。这些方法可以在常规精液分析后作为补充来检测特发性和非特发性少精症。此外，还可以为那些精液常规检查正常但伴侣经历反复流产、植入失败、在辅助生殖时有复发性早期流产的不育男性提供更多的信息。

5．精子染色体非整倍体检测：

　　非整倍体精子受精可导至胚胎染色体非整倍体，是引起智力障碍、妊娠失败和染色体病的主要原因之一，因此检测精子染色体非整倍体具有重要意义。目前检测精子染色体非整倍体的主要方法有精子穿透试验和荧光原位杂交(fluoresence in situ hybri dization，FISH)法。前者操作精细复杂，十分耗时，在临床上推广和应用受到很大的限制。近年来FISH技术迅速发展，可以使用五色荧光直接检测性染色体和13、18、21号染色体，具有荧光信号直观易分辨、短时间内可检测分析大量精子、可自动化等优点，而且实验结果具有高度的敏感度、特异度和准确性。但由于报告的是非整倍体精子的比例，因而建立统一的参考范围将更有助于临床应用。

参考文献（略）

节选自《中华检验医学杂志》，全文有删节，阅读全文请浏览杂志。

来源：中华检验医学杂志　　作者：解放军第二○二医院检验科刘政、王喜良、邱广斌