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[分享] 免疫组化质量控制的标准化管理

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发表于 2016-1-9 22:27:42 | 显示全部楼层 |阅读模式

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  免疫组化染色技术在现代病理诊断中的应用日益广泛, 对各类肿瘤的确诊及鉴别诊断具有重要意义,而且在肿瘤患者个体化治疗、靶向治疗方案的选择及预后判断方面越来越受到临床医生的青睐,已经成为病理诊断中不可或缺的辅助手段[1]。因而很多单位,包括基层医院也开展了这个项目。随之而来的是,免疫组化质量控制问题也凸显出来了。这其中有实验员操作不当的因素,也有其他的因素,如组织固定不好、试剂效价和试剂盒质量问题等等,各免疫组化实验室质量管理水平参差不齐[2,3]。目前国内尚无免疫组化标准化管理的统一标准,因而在众多繁杂的条件中,探索找到一个相对稳定的免疫组化质量控制的条件,即所谓的标准化管理方法具有重要意义。笔者根据本科室的实际情况,总结免疫组化室内质控管理的一点心得体会,从实验前、实验中、实验后三方面浅谈免疫组化室内质量控制如何实现标准化管理。
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  1、实验前的标准化管理
  1.1 组织处理的标准化
  组织处理得当是成功制片的关键,对免疫组化染色结果的影响尤其重要,主要包括取材、固定、脱水等环节。如果组织处理不良,那么在其后的任何阶段均难以补救。组织或细胞固定的目的是使细胞内蛋白质凝固,终止或减少外源性或内源性酶的反应,防止细胞自溶,以保持组织细胞的固有形态和结构,更重要的是保存组织或细胞的抗原性,防止抗原的丢失或弥散。因此,标本应尽可能保持新鲜并及时进行固定。我们科室积极与临床一线沟通,宣传固定的意义、方法和要求,拟定以下标准:手术标本离体后30分钟内,用10%中性缓冲福尔马林固定。固定时间为小标本6~12 h,大标本12~24 h。组织取材厚度为3~4 mm,放入全自动脱水机进行脱水[4]。组织处理不好对抗原修复也产生影响,热修复时脱片的概率将会增大。

  1.2 免疫组化切片的标准化
  1.2.1 玻片处理及切片厚度
  用于免疫组化的玻片一般都需要进行防脱片涂胶处理,目前常用的有氨丙基三乙氧基硅烷和L-多聚赖氨酸,防脱片的效果对比其他粘附剂都要好[5]。我们采用的是L-多聚赖氨酸,效果很好。采用3~4 μm连续切片[6],切片厚度不能过于求薄,太薄由于抗原的减少,会导至抗体阳性表达的减弱,也不宜太厚,太厚在热修复过程中容易导至脱片。

  1.2.2 抗原修复方法
  福尔马林固定组织导至组织中抗原决定簇封闭,也就是组织细胞经福尔马林固定后,导至抗原决定簇的三维结构发生异常改变,使抗原决定簇被掩盖或原来位于表面的一些抗原决定簇因折叠而形成隐蔽的抗原决定簇,因此抗原的理化性质发生了显着的变化,表位空间结构改变导至许多抗原免疫活性丢失。但这一变化是可逆的,可通过抗原修复。目前抗原修复有两种方法:酶消化法和热修复法。
  抗原修复方法的选择关系到组织抗原能否暴露充分,这对免疫组化染色结果有很大影响。有很多文献比较了各种抗原修复方法的优劣,目前,被认为效果最好、最常用的修复方式为高压加热修复[7-9]。我们将微波加热与高压加热的方法进行比较,发现阳性定位于细胞核的抗体,如P53、Ki-67等的核表达,在高压修复后明显强于微波修复,因此我们选择高压加热修复,抗原修复液为柠檬酸盐,修复时间为高压锅出气后2 min自然冷却,时间过短,抗原暴露不够,时间过长,导至背景过深。

  1.2.3 抗原修复液的选择
  加热抗原修复缓冲液有多种如柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)、Tris(pH7~8)、EDTA(pH8.0)等,目前首选柠檬酸盐缓冲液(pH6.0),优点是染色背景清晰, 适合于大多数抗体。Tris和EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强,但其染色背景同时加深,如使用不当易造成假阳性结果。值得注意的是,没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体,柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液,但也不能除外某些抗体适于用EDTA和Tris缓冲修复液。一般抗原比较难于表达的抗体多选择后两者。

  1.3 试剂管理的标准化
  1.3.1 试剂清单及使用记录的管理
  试剂的种类、公司有很多,为了方便管理,我们创建了一个“免疫组化试剂登记表”Excel电子表格,进行试剂清单的管理,简洁又规范。登记表的内容包括抗体名称、类型、稀释度、是否修复、克隆号、编号、批号、公司名称、库存量、有效期、接收日期、启用日期、用完日期等,也可以根据各单位实际情况自己添加内容。所有试剂应保证在有效期内使用,只有这样才能确保抗体的效价。因此,登记表中有效期、用完日期的记录要求完整准确,过期试剂或者失效试剂应丢弃不用,并备注原因。每种试剂的使用情况都要记录在案,建立超链接。

  1.3.2 冰箱温度控制及试剂的摆放
  所有的试剂均应在试剂公司建议的温度下保存,储存试剂的冰箱应每天检查,建立一个冷藏冰箱温度监测表,并按时记录温度值。不管是浓缩型还是即用型试剂,如果是一堆地放在冰箱里,要用或配置的时候找起来比较麻烦费事,我们自己设计制做了几个试剂摆放的木架子,将免疫组化试剂按首字母A→Z排列,同系列的按数字从小到大依次排列,如Actin、AFP、Bcl-2、CA125、CD10、CD117等依次排列,这样找试剂比原来方便许多,节省时间,看起来也比较整洁。

  1.3.3试剂配置
  免疫组化的试剂分为即用型和浓缩型两种,浓缩试剂的配置,需要对抗体滴度(稀释比)进行评估。我们参考公司推荐的抗体滴度,在其前后各增加一个实验滴度,如公司推荐1∶200,我们配置1∶100、1∶200、1∶400三种滴度,进行预实验,以观察阳性细胞染色强度及非特异性染色,验证试剂的可靠滴度,然后才能在常规的实验中应用。

  2、实验中的标准化管理
  2.1 检测方法的选择
  免疫组化的检测方法有很多种,大致分为生物素型和非生物素型两大类。因组织中含有内源性生物素,所以会干扰免疫组化的染色结果,在生物素型检测方法的操作过程中,要阻断内源性生物素干扰。非生物素型聚合物检测,可以有效地防止内源性生物素的影响,并且灵敏度高,操作简便,为很多实验室采用,是目前免疫组化标准化染色的首选方法。我们采用的是非生物素型EliVision二步法,检测方法比较稳定,效果也好。

  2.2 免疫组化染色操作标准化
  目前,免疫组化染色分手工操作和全自动免疫组化仪操作。在手工染色过程中,或多或少要受到实验员个人因素的干扰。全自动免疫组化仪的出现,避免了操作过程中人为因素的干扰,增加了染色结果的可靠性,有助于免疫组化质量控制的标准化管理。我们采用全自动免疫组化仪进行染色,与手工染色相比,具有以下技术优势:
  ① 精确的抗体孵育时间控制,确保染色质量,避免背景非特异性着色;
  ② 精确的抗体浓度以及量的控制,避免因实验员手法不同而导至抗体浓度被稀释,影响染色强度的表达,还可以避免交叉污染和非特异性染色的产生;
  ③ 二维码的识别,可以使滴加试剂的时候不会产生滴错的现象,避免人工滴加错误,导至假阴性或假阳性结果的发生;
  ④ 可根据实验员的工作需要,统筹安排,能更加合理高效地利用时间;
  ⑤ 程序结束后可以保存整个进程,如果出现问题,可以在实验结束后复审,以便查找出问题的原因[10]。

  2.3 阳性与阴性对照
  每一次免疫组化染色必须严格设立阳性对照和阴性对照[11]。我们的方法是,每个抗体都备有一个阳性对照的小蜡块,阳性对照小蜡块的准备:取材的同时,从大体标本中重新取材,制作成大小约为0.4 cm×0.3 cm×0.3 cm的组织块,一起脱水包埋。时间应控制在48 h之内,用以保存组织抗原;常规HE切片染色,镜下观察有癌组织后,进行所需抗体表达测定,评估适合作为阳性对照后放置备用。阳性对照小蜡块主要目的针对试剂的不同批次、重新配置、滴度预试验等,用来评估试剂的可靠度。在实验过程中将待测组织与阳性对照小蜡块组织裱于同一张切片,PBS代替一抗作为阴性对照,然后进行染色,实验结果更可靠、更节约成本,这一方法值得推广应用。

  3、实验后的标准化管理
  3.1 染色结果判断的标准化
  免疫组化切片应是阳性标记强而非特异性染色淡或无,两者形成鲜明的对比,阳性表达必须在细胞或组织特定的部位,细胞边界清楚;每批染色都要有阳性对照、阴性对照和自身对照才能对染色结果作出正确判断。判断标准常根据阳性细胞的百分比或阳性细胞的染色深度来判断,其颜色深浅反映抗原量的多少。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。阳性反应分布总是有规律、局限、定位准确和一定形态特征的,如细胞膜着色呈圆形;典型的细胞核着色为均质状,核仁和染色质呈颗粒状着色。细胞浆呈颗粒状(位于细胞器)或纤维状(中间丝或微丝)或弥漫片状(细胞内液、病毒颗粒及吸收蛋白)着色;细胞间质呈纤维条块状着色;若阳性结果定位异常象征着疾病过程。非特异性着色为无规律、**线、定位不准确且不能重复;结缔组织受染和内源性生物素干扰是最常见的非特异性着色,镜下为均匀细颗粒状的浅棕色,但不会出现在细胞膜或细胞核。
  由于免疫组化染色结果是定性指标,不能定量,染色结果判断受到诊断医师的主观因素影响而导至结果差异。为了减少这种差异的发生,我们科室内部采用统一的免疫组化染色结果判定标准,严格按照公认的分级标准进行判定,如乳腺癌ER、PR采用Bessley分级法[12],C-erbB-2采用美国临床肿瘤协会(ASCO)/美国病理学家学院(CAP)HER2检测指南等[13]。

  3.2 实验结果的跟踪、记录
  每批次的免疫组化结果,进行质量跟踪记录,对于特别异常的结果,应该分析原因。是新购试剂,还是新配试剂,或者是操作过程中有无异常;全自动免疫组化仪染色的可以把程序调出来复审,然后备注分析的原因,重新设立阳性对照再染色,观察效果,直到问题解决为止。对于一些单位来说,配置的浓缩试剂,在经过一段时间后,也要进行阳性强度的评测,以防止配置时间过长后效价的降低,导至阳性强度的减弱。

  3.3 试剂的库存管理
  实验结束后,需要在“免疫组化试剂登记表”中,对于使用的试剂进行数据的更新,以便及时更换采购试剂。

  3.4 实验室的清洁、整理
  清洁工作场所内的脏污,必要的东西分门别类以一定的顺序放置,保持工作场所干净、整洁。对于使用过的仪器,做好仪器的日常维护,记录使用情况。另外,实验室的卫生对于实验人员也有一定的安全保护作用。

  4 讨论
  免疫组化质量的好坏影响的因素方方面面。要确保免疫组化结果的可靠性和稳定性,加强免疫组化室内质量控制管理,制定相应质控标准尤其重要。笔者结合本科室的实际情况,对实验前、实验中和实验后三个层面可能影响免疫组化染色结果的因素进行分析、总结,制定本科室免疫组化室内质控管理相关细则,在日常工作实践中得到检验。我们发现,标本及时用10%中性福尔马林固定,取材大小适当,组织良好的脱水,切片的厚度适宜并做防脱片处理,选择高压热修复,抗体效价的评估,采用全自动免疫组化仪代替手工操作,并做阳性与阴性对照,依照公认的免疫组化判断标准等因素,是一个相对稳定的免疫组化室内质量控制的条件。各个环节制定相应的质控标准,以达到标准化管理目标。另外每个实验室应当建有本实验室免疫组化检测的SOP文件,所谓的SOP是指 Standard Operation Procedure三个单词中首字母的大写,即标准作业程序,就是将某一事件的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来,用来指导和规范日常的工作。定期做好实验室室内质量控制,真正把SOP文件应用到实际工作中去。每一个实验人员在进行免疫组化操作的时候,也应该有严肃的态度和高度的责任心,才能在制片过程中做到一丝不苟,才能做出优秀的切片。制度化、规范化操作是实现标准化操作的前提条件[14,15],全自动免疫组化仪器的使用是必要手段,阳性和阴性对照的设立是结果可信的可靠保证,稳定良好的染色质量和可靠的结果判读才是免疫组化质控标准化管理的最终目的。

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来源:论文网

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