无创产前诊断技术之“哼哈二将”

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DNA分子计数技术对无创产前检查之影响

小孩子到了一定年纪，都会对自己从哪里来产生兴趣，这个问题往往让父母支支吾吾、闪烁其词。廖信忠在《我们台湾这些年》提供了一个答案，印象深刻。他妈妈当年这么回答，大意是：爸爸给妈妈打了一针就有了你，颇具禅机。

王小平在《我的兄弟王小波》“写在前面”的部分对遗传因子的描述很得要领：“一个人本质上相当于一个万花筒。在出生之前，这个万花筒被造物之手簸动，衍生出难以计数的花纹。但一旦出生，此图案就此凝结”。遗传病本质上就是凝结成的图案有了瑕疵，这个过程从进化的角度看再自然不过，但对个人和家庭着实不幸。

听同事说她一个朋友孩子出生的时候，作为医生的父亲关心的不是宝宝是男是女，而是先检查娃娃十个手指，十个脚趾是否齐全。那些迎接宝宝降临人间的父母们，心态估计就像《阿甘正传》里面那句经典台词：生命就像一盒巧克力糖，你永远不知道盒里乾坤。

好在母体内胎儿游离DNA的发现，为无创产前检测提供了更多的可能。DNA分子计数技术的出现、成熟与广泛使用，使得对胎儿游离DNA的检测达到前所未有的精度，从而实现对不同遗传疾病的检测，无论是单基因遗传病还是染色体的非整倍性疾病。本期推荐由香港中文大学Dennis Lo实验室的Allen Chan教授撰写的综述，介绍数字PCR和NGS（深度测序对每个DNA分子进行序列读取，当然也可以看成是一种核酸层面的计数技术）这两种DNA分子计数技术在NIPT方面的应用及带来的影响。

早期发展

1997年，Dennis Lo通过普通PCR扩增的方法证明了胎儿游离DNA的存在，该发现奠定了日后通过母体血浆中胎儿游离DNA的分析进行NIPT的基础。早期对胎儿游离DNA的检测主要集中在对父源性特异序列的定性分析，如果在母体血浆中检测到这些靶标序列，那就证明胎儿经遗传获得了父本的特异性序列。该策略的一个早期应用是通过RHD基因的序列分析进行Rh阴性血怀孕妇女的监控。

目前通过对父源性血浆游离DNA的分析进行NIPT，已经扩展到常染色体显性遗传类疾病，如软骨发育不全、肌强直性营养不良和亨廷顿氏舞蹈症等。但该策略不能应用于其他遗传模式的疾病，诸如母源性导至的常染色体显性遗传类疾病、常染色体隐性遗传类疾病和染色体的非整倍性疾病。因为这些情况下，无论胎儿是否获得致病序列，在血浆内都能检测到来源于母亲本身的靶标序列。因此需要更精确的检测技术及更强大的数据处理方式。

DNA分子的“数字式”计数

数字PCR对DNA在单分子层面的绝对计数流程与工作原理见下图。在数字PCR之前，广泛采用的荧光定量PCR通过Ct值对核酸进行定量计算，这种定量方法的理论依据是在每轮PCR循环后PCR的扩增产物翻倍，因此荧光定量PCR最小能分辨2X差异的情形。数字PCR采用计数的方式进行定量，因此检测精度更高，甚至根本不需要荧光定量PCR检测中需要的标准品。（数字PCR技术的原理、发展历程、操作流程及大致应用在本公众号的第一期和第二期有详细的介绍）

不同的数字PCR设备

早期的数字PCR往往手工进行反应体系的partition，一般在几百个partition number的水平，耗时且操作繁琐。目前越来越多的商业化数字PCR平台面市，实现了该技术的高通量、自动化。不同厂商的设备及主要性能见下表。

Fluidigm最早采用微流控芯片的方式实现了商业化的数字PCR，partition number接近1000，但该方式成本较高，尤其对于常规的临床检测而言。之后面市的基于“油包水”方式的微滴式数字PCR使用成本更低，相信在NIPT领域比微流控芯片的数字PCR有更好的应用前景。原文引述如下：

As the marginal cost for generating droplets is low, droplet digital PCR systems have gained popularity over microfluidic chip digital PCR system in NIPT service.

大规模平行测序（Massive parallel sequencing, MPS）

对于NIPT，MPS是一种有力的工具，能在一个反应里对血浆中成百万的DNA进行测序。数字PCR实验方案的设计需要以明确的靶序列信息为前提，而MPS完全不需要，这尤其使得MPS在染色体非整倍性疾病的分析方面具有优势。但目前来看，MPS在实验成本及检测时间上不如数字PCR。原文引述如下：

This characteristic is of advantage over multiplex digital PCR for analyzing different chromosomal regions simultaneously, making MPS particularly useful for aneuploidy detection. However, MPS is still much more expensive than digital PCR, and the turnaround time of analyzing a sample takes longer than digital PCR.

胎儿DNA浓度的测定

了解胎儿DNA在母血内的浓度是NIPT的质控标准之一，对后续的数据分析至关重要。早期测定胎儿DNA浓度的方法是利用荧光定量PCR分别测定胎儿特异性序列和胎儿、母体共有序列的方式来实现。通过测定SRY基因，孕早期和孕晚期胎儿DNA的平均含量分别为3.4%和6.2%。采用数字PCR检测后发现，胎儿DNA的含量更高，在早、中、晚期的含量分别是9.7，9.0和20.4%。

单基因病的检测

对于常染色体隐性遗传类疾病和常染色体显性遗传类疾病，携带者具体突变的定性分析是不够的，一种称为Relative mutation dosage（RMD）的分析是必要的，这种分析的原理见下图，其中假定胎儿DNA的含量占母体血浆的10%。

按上图所示，如果胎儿是纯和的野生型或突变型，那么母体血浆内不同等位基因间总体的最大差值就在20%。如何对如此小的差异进行分析？Dennis Lo实验室采用了一种称为sequential probability ratio testing（SPRT）的统计学算法，具体模式及举例见下图。

下图的例子中，母亲是某种常染色体显性遗传疾病的携带者，父亲是纯和野生型。其中横坐标是母体血浆中总共被分析的分子数，纵坐标是野生型对突变型的比例。如果该比例落在颜色区域，结果则具有统计学意义。如果落在红色区域，说明胎儿的基因型为野生纯和；如果落在蓝色区域，说明胎儿的基因型为杂合。SPRT分析中，实际需要分析的分子总数目不能在实验前确认。下图的例子中显示，总共经过了4轮测试得出具有统计学意义的结果。这种分析策略可以用于诸如地中海贫血、血友病和甲基丙二酸血症等遗传病的检测。

注：如对SPRT分析想做进一步了解，请参看论文：

• Lo YMD, Lun FMF, Chan KCA, et al. Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104(32):13116-21
• El Karoui N, Zhou W, Whittemore AS. Getting more from digital SNP data. Stat Med 2006;25(18):3124-33
  
  

染色体的非整倍性分析

通过母体血浆DNA的分析来确认染色体的非整倍性状况，在技术上面临挑战。如果假定胎儿DNA占母体血浆总DNA的10%，理论上唐氏综合症胎儿导至21号染色体含量的增加只有5%。早期检测技术不可能对如此小的差异进行分析，所以早期NIPT的努力方向致力于发现胎儿与母体之间差异化的基因序列（如SNP位点、甲基化位点等），再针对这些差异序列进行分析。但这样的工作思路不够理想：1、寻找这些差异化位点耗时耗力；2、找到的差异化位点不能适用于所有人群。

不断涌现的DNA计数技术大大加速了利用通用序列对染色体的非整倍性进行分析。目前只需要对母体血浆DNA中的目标染色体（例如21号染色体）和参照染色体分别进行计数，就能得到chromosome dosages。具体分析中，被分析的分子总数目决定了结果的精度及统计学上的有效性。如果胎儿DNA的含量较低，就要求有更多的DNA分子被分析（被计数）。计算表明：如果母体血浆内胎儿DNA的含量减少50%，那么数字PCR分析的DNA分子数目需要增加400%。本综述同时对胎儿DNA的含量与总共需要被计数分子数目之间的关系进行了计算，见下图。如果胎儿DNA的含量为5%，那么在灵敏度95%和特异性99%的条件下，总共需要计数21号染色体DNA的分子数为100,000个，同时作为参照的染色体计数总数也需要在相同的水平。

通过上述计算，采用数字PCR技术进行非整倍性分析几乎是不可能的，因为在常规采血量的条件下不可能获得如此数量级的分子数。但如果对目标染色体与内参染色体上进行多个位点的同时检测（多重检测），可以在不提高采血量的情况下增加被计数分子的总数目。这不失为一种利用数字PCR技术进行非整倍性分析的思路，原文如下：

Practically, it is difficult to use a monoplex digital PCR analysis to achieve this large number of molecules because a large volume of plasma would be required. However, if multiple targets on the potentially affected chromosome are analyzed, then digital PCR analysis for aneuploidies would still be possible with a reasonable volume of plasma.

上述设计思路在RainDance公司编号为LCN 50-07052 Rev A的Application note中已经进行了初步尝试，具体实验方案见下图。对21号染色体和18号染色体分别检测20个位点，采用Roche公司的Universal Probe Library (UPL)，其中18号染色体采用FAM检测，21号染色体采用TET检测。当然，实验人员也可以根据NGS的结果来选择染色体上的具体位点及检测位点的个数。

数字PCR技术之外，NGS已经成为NIPT进行染色体非整倍性分析的成熟技术，主要的工作来自Dennis Lo实验室一系列奠基性的工作，不再赘述。可参考其中最关键的文献。

• Chiu RWK, Chan KCA, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105(51):20458-63
• Chiu RWK, Akolekar R, Zheng YW, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ 2011;342:c7401
• Chen EZ, Chiu RW, Sun H, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing. PLoS One 2011; 6(7):e21791
  
  

来源：数字PCR的可能性  作者：陈寅清