2015 CSCO热点技术之ddPCR、NGS和CTC

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液态活检之微滴式数字PCR、 二代测序和循环肿瘤细胞

本月结束的2015年度CSCO年会上，“血液检测”在各个会场成为热点话题。“液态活检”在肿瘤的早期诊断、用药监控、预后判断等方向的重要性日趋明朗，同时也能感受到从学术、临床到产业界之间越来越明确的共识。液态活检按照检测样品分类，主要有2大方向：循环肿瘤核酸（circulating cell-free tumor DNA, ctDNA）和循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）。对于上述2类对象，可分为两种检测平台：深度测序和数字PCR。相比于目前主流的NGS，数字PCR在如下方面优势突出：操作快速、简便（测序前无需对来源于CTC的DNA进行预扩增）；无需复杂的生物信息学分析；检测灵敏度高等。

下面我们以莱斯特大学（University of Leicester）、伦敦帝国学院（Imperial College）最近发表在Clinical Chemistry上的研究成果为文本，梳理ddPCR、NGS和CTC三者在转移性乳腺癌病人中ESR1（Estrogen Receptor 1，雌激素受体1）突变液态活检的具体应用和初步结果。

背景：

超过70%的原发性乳腺癌患者为ER（雌激素受体）阳性，激素治疗对这类病人在治疗初期往往有效。随着治疗的深入，相当比例的病人对抗雌激素或芳香化酶抑制剂（AIs）治疗出现耐药。配合NGS的使用，发现ESR1基因上p.L536, p.Y537，和p.D538位点的突变是导至耐药性的主要原因之一。

样品：

• 共54名病人，其中48名为ER阳性，持续接受激素治疗；1名病人为原发癌，原位复发；5名病人为ER阴性。其中53名病人都是转移性乳腺癌。
• 病人2ml血浆中的cfDNA与对应的淋巴细胞作为对照，进行突变对比分析。
  
  

方法：

• 通过CellSearch System（目前唯一通过FDA批准的CTC检测设备）在7.5ml血液中获得循环肿瘤细胞。其中3名病人7.5ml血液中的CTCs超过100个，可直接通过NGS与对应的cfDNA进行比对，无需经过全基因组的预扩增处理。其他获得的CTC DNA经过Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit预扩增后进行深度测序。（GE Healthcare Life Sciences）
• 采用The Ion AmpliSeq designer 3.0设计了23个扩增子的Ion AmpliSeq Panel来分析ESR1（11%的覆盖率）、TP53、PIK3CA、FGFR1和FGFR2共5个基因中的热点突变。扩增子产物范围125～175bp，测序在316芯片上完成，文库构建核酸起始量分别为1-10ng cfDNA和5ng／淋巴细胞或CTC DNA。
• 对上述经NGS测序发现的ESR1 p.D538G, PIK3CA p.E545K和TP53 p.R175H位点在Bio-Rad QX200微滴式数字PCR平台上采用双重ddPCR进行验证，同时计算各位点的突变率。其中对于ESR1 p.D538G的检测，野生型和突变型的探针进行了LNA的修饰，更好地确保检测结果的特异性。（对于PIK3CA p.E545K和TP53 p.R175H位点，PrimePCR ddPCR Mutation Detection产品系列已经有ready-to-use的试剂盒提供，检测灵敏度至少可达1/2000）
• 同时对病人血清进行CA15-3（肿瘤相关抗原）和ALP（碱性磷酸酶）生化分析。
  
  

结论：

• 48名ER阳性病人cfDNA NGS结果：3名病人中发现p.D538G(46.3%), p.Y537S(2.8%), 和p.E380Q (24.4%)突变。其中具有p.E380Q突变的病人同时为PIK3CA和TP53突变。
• 5名ER阴性病人cfDNA NGS结果全部为阴性。
• 48名ER阳性病人cfDNA ddPCR结果：对ESR1 p.D538G位点进行确认，除NGS发现的3例病人外，还发现了6例（突变率都在1%以下），总共9例，使检出率提高到18.75%。
• CTCs和总cfDNA含量高度相关（P =0.000384）；CTCs和生化指标也呈现正相关，CA15-3（P =0.0010）；ALP（P =0.0168）。但本研究未发现CTCs和具体位点的突变率呈现相关性。
  
• 通过对11名乳腺癌转移病人血液样品连续监控发现，其中4名病人cfDNA中的突变存在显著变化。例如一名病人ESR1 p.D538G分别从治疗前的3.1%上升至治疗5个月后的46.3%；另一名病人在治疗前ESR1 p.D538G为0.4%，治疗3个月后上升至13.6%。
  
  

本文观点：

• 治疗前32个病人中的CTC<5，与之前的研究一致，在7.5ml血液中CTC数值是乳腺癌患者的一个独立预后指标。
• 相较于将CTC来源的DNA作为测序对象进行深度测序，ddPCR对cfDNA来源的突变直接进行检测具有更高的灵敏度。
• CTC数值和cfDNA中有无突变（P=0.0026）及cfDNA总含量具有相关性，但和具体位点的突变率无相关性。
• 作为液态活检的2大来源，细胞层面的CTC还是分子层面的cfDNA哪个在临床上更具有应用价值还需要深入讨论。也许随着研究的深入、临床测试的进一步展开，CTC和cfDNA具有各自不同的应用价值。但本研究已经明确揭示了“液态活检”这个概念在肿瘤预防、治疗等方面的重要性。
  
  
  

本届CSCO的几点体会：

• 血液检测的分析能够反映肿瘤病灶的整体水平，思路有点像我们常说的“活要见人，死要见尸”，这里“人”指肿瘤细胞，“尸”指包含核酸和蛋白在内的各种肿瘤标志物。目前来看，分子标志物的检测相对比较成熟，临床意义明确。循环肿瘤细胞的检测及临床意义还需深入研究，一旦突破，意义重大！因为拿到的是完整的肿瘤细胞。
• ctDNA的NGS分析，对各种肿瘤相关基因的覆盖度方面具有优势，如本文献中能利用深度测序发现多个ESR1基因耐药相关的突变位点及其他相关基因的突变。
• ctDNA的ddPCR分析，以操作快速、灵敏度高及简捷的突变率计算见长。
• 在ctDNA的检测方面，NGS和ddPCR的联合使用是大势所趋。国际肺癌研究学会（IASLC）主席Tony Mok（莫树锦）会议期间提及的肺癌相关基因突变检测的方案中就体现了这一趋势。（下图摘自Tony Mok在会议上的演讲）
  
• 国内也有多个实验室在同时采用ddPCR、NGS和CTC进行不同肿瘤的血液检测，不久也会有类似的研究结果。
• 本届CSCO上各参展商的宣传来看，产业界的共识也在逐渐明确：对付肿瘤需要各种技术齐上阵，单打独斗搞不定。
  
  

来源：数字PCR的可能性  作者： 陈寅清