【分子标志物与肺癌精准诊疗】基于外周血的“液态活检”研究 现状及进展

检验医师

通过动态分析外周血所携带的肿瘤信息，可以提示疾病进展以及更准确地指导治疗，甚至可以实现早期诊断及监测疾病复发。另外，由于外周血是肿瘤转移的主要途径，对外周血进行基因分析还有助于探寻肿瘤转移机制。目前，在肿瘤学领域，基于外周血的相关研究多是关于循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells， CTC）和循环肿瘤DNA（Circulating Tumor  DNA，ct-DNA），本文将对二者在肿瘤中的应用现状、研究进展以及面临的问题与挑战进行综述。

近年来，随着分子生物学技术的发展，基于病理形态学的肿瘤诊疗模式正逐渐向分子分型方向转变，分子分型基础上的靶向治疗已成为癌症治疗的重要手段之一。

无论是病理诊断亦或分子诊断，组织标本仍然是“金标准”；对于大多数无法进行手术的患者，通过活检获取组织标本是明确病理和分子分型的主要方式。遗憾的是，相当一部分患者无法获得组织标本或者组织标本量过少而无法进行分子分型诊断，从而失去靶向治疗的机会；另外，由于肿瘤异质性的存在，局部穿刺标本难以准确反映肿瘤的全貌，而且随着治疗选择压力导至的肿瘤演变以及耐药基因的出现，仅依靠治疗前组织标本指导后续治疗可能会导至治疗的偏倚，而是需要动态活检、实时监测以更好地指导治疗，但这在临床实践中难以实现。

外周血含有肿瘤细胞以及游离DNA、RNA和蛋白，可以一定程度上反映肿瘤的特征，而且无创、易获得，是具有前景的肿瘤组织替代品，被称为“液态活检”标本。

CTC

CTC研究现状及进展

循环血流中的CTC来源于原发肿瘤或转移病灶，其在血液中的含量波动在数个至几千个，大约109个血细胞中含有1个CTC，分离尽可能多的CTC是针对其进行研究的关键前提。目前，CTC的分离技术主要基于细胞大小（如ISET法）和抗原抗体反应（如CellSearch法）的分离平台，以及基于微流控装置的CTC-iChip法。虽然CellSearch法存在一定的缺陷，但因其检测方法标准化、流程化且重复性较好，是目前最常用的CTC分离技术。

既往大部分研究显示，治疗前的CTC数量可以提示疾病的预后，1～2周期化疗或放疗后CTC数量下降提示化疗或放疗的无进展生存（PFS）期较长。然而，需要注意的是，这些研究定义CTC阳性或阴性的界值并不统一，受限于CTC分离技术及采集时间点的影响，所研究的CTC未必代表所有CTC的真实数量。另外，以此治疗后的观察指标来判断疗效是后知后觉。因此，基于CTC数量进行疾病预后分析及疗效预测尚难以广泛应用于临床。

虽然CTC仅是肿瘤的一部分，但受白细胞等正常细胞的干扰远小于ct-DNA，因此进行基因检测的敏感性和特异性均优于ct-DNA。

Maheswaran等采用ARMS的方法对比检测18例组织EGFR突变的NSCLC患者，其中17例在CTC中检测到EGFR突变（94%），仅有7例在血浆标本中检测到EGFR突变（39%）。另外，在14例EGFR-TKI耐药患者中，9例患者CTC被检测T790M突变（64%），与组织中的比例类似。

除基因突变外，基因重排也是重要分子事件，如ALK融合基因。Pailler等对18例ALK融合基因阳性的NSCLC患者CTC进行荧光原位杂交（FISH）分析（FISH阳性病例被定义为FISH阳性的CTC数目≥4个），结果发现，均为ALK融合阳性。Attard等在前列腺癌CTC中也成功检测了TMPRSS2-ERG重排，而且同时检测了AR拷贝数变异及PTEN缺失。这些研究结果提示，基于CTC的基因突变及融合基因检测是可行的。

然而，肿瘤是一种基因组疾病，随着二代测序技术（Next-generation Sequencing， NGS）的发展，CTC也进入全基因组分析时代。Kanwar等分析了787例乳腺癌患者CTC的基因组拷贝数变异（copy number variation，CNV），将乳腺癌分为两个亚型（休眠型和侵袭型）。Chiu等通过分析黑色素瘤CTC的CNV，发现CTC的CNV特点更接近转移灶，且携带不同CNV型的预后也不同。作者所在团队分析了小细胞肺癌（SCLC）CTC的基因组CNV模式，发现敏感性SCLC表现为MYC和RLN1的获得，而难治性SCLC则表现为PIK3CA和SOX2的获得以及FHIT的缺失。这些基于群体CTC的研究提示，基因组CNV分析有助于进行不同个体间的亚型分类。

实际上，在同一患者体内也存在不同的亚克隆群，既往研究显示CTC是一群异质性的细胞群体，存在形态以及基因变异的不同，因此仅仅进行群体CTC的分析是不够的，单个CTC的分析无疑可以更好地反映肿瘤的异质性并揭示转移的机制。然而，由于单个CTC中的DNA含量极低，如何有效扩增单细胞基因组DNA则成为单个CTC分析的主要阻碍。目前，多个研究团队进行了单细胞水平的基因组扩增研究，主要的方法包括：退变寡核甘酸引物多聚酶链反应（Degenerate Oligonucleotide-Primed Polymerase Chain Reaction，DOP-PCR）法、多重置换扩增（Multiple Displacement Amplification，MDA）法以及多重退火和成环循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping-Based Amplifications Cycles，MALBAC）法。其中，MDA 法的基因覆盖率最高，但MALBAC法和DOP-PCR法的重复性更好，而且MALBAC法的假阳性率和错配率更低，可见MALBAC法是目前较为理想的一种基因组扩增方法。

作者所在团队与哈佛大学谢晓亮团队合作，对肺癌单个CTC进行了基因组分析，发现同一患者的不同CTC间单核苷酸变异/ 插入缺失（SNV/InDel）存在异质性，但总体特征接近转移灶；而不同CTC间CNV一致性较好，可以区分不同的病理类型，尤其可以鉴别可能发生病理表型转化的人群；而且CNV不随治疗发生改变，提示CNV模式可能代表肿瘤固有的特性，因此有可能成为潜在的诊断手段。除了基因组的分析，Ting等进行了单个CTC转录组学的分析，发现CTC同时具有“上皮”和“间叶”来源相关基因的高转录，提示CTC存在上皮间叶转化（EMT）的过程。既往研究显示，肿瘤转移可能是由于CTC发生EMT-间叶上皮转化（MET）转化或含有肿瘤干细胞导至，因此结合基因组、转录组学以及生物信息学进行单个CTC研究极有可能为揭示肿瘤的转移机制提供契机。

CTC作为相对完整且具有活性的细胞体不仅可用于离体的基因分析，还可作为活体模型进行药敏试验和新药开发。Yu等采用CTC-iChip法分离乳腺癌CTC并体外培养成稳定细胞系进行药敏试验，筛选出针对不同乳腺癌基因型的有效治疗方案。Hodgkinson等将SCLC的CTC直接接种小鼠建立动物模型，并验证了这种动物模型在病理形态、基因型及治疗反应方面与原发肿瘤类似，提示了该模型的可行性。另外，由于CTC更可能代表具有转移潜能的一部分肿瘤细胞，因此利用CTC基础上的体外、体内模型开发药物有可能成为攻克肿瘤转移的手段。

CTC研究面临的问题及挑战

CTC研究面临的首要问题是开发更准确、高效的分离技术。由于部分CTC在外周血中可能发生EMT转化，因此目前常用的以上皮细胞膜抗原进行CTC分选的CellSearch法会漏掉这部分CTC。虽然基于可同时识别多个上皮及间叶抗原的分离技术以及其他新的分离技术如CTC-iChip等可以更有效地分离出CTC，但这些技术并未实现标准化流程，因此得出的数据在各中心的重复性会受到影响。另外，在样本处理及分离过程中难免存在CTC的破坏和丢失。因此，需要开发高效并且标准化、流程化的CTC分离技术，才能获得更有意义的CTC数据。

既往研究显示，CTC在循环血流中的存在时间约24小时，提示并非每个时间段或时间点均可有效地采集到CTC，因此标定CTC采集的时间点是高效收集CTC面临的另一个问题。

除此之外，提高CTC动物模型的接种成功率以及降低CTC的分离检测费用也是需要解决的难题。

ct-DNA

ct-DNA研究现状及进展

外周血中的有核细胞如白细胞等凋亡、坏死，释放出以游离单链或双链形式存在的游离DNA（Cell-free DNA，cf-DNA），这些片段多在160～180个碱基对之间。对于肿瘤患者而言，一部分cf-DNA来源于肿瘤细胞，被称为ct-DNA。然而，目前尚无有效手段明确区分ct-DNA或非ct-DNA。外周血中既然存在ct-DNA，就可通过对ct-DNA进行基因分析来反映肿瘤的遗传信息；而且ct-DNA反映的是肿瘤的整体特征，可在一定程度上避免肿瘤异质性带来的局部穿刺偏倚。然而，外周血中ct-DNA的含量很低，而且被大量的正常细胞cf-DNA污染和稀释，因此，正常cf-DNA含量较低的血浆相比血清更适于ct-DNA检测。

血浆ct-DNA的获得操作简单、无创，且价格低廉，相较于CTC更可能广泛用于临床实践。基于此，近年诸多研究评价了血浆ct-DNA用于驱动基因突变检测的临床可行性，如EGFR、K-Ras、BRAF以及PIK3CA等。其中研究最多且最可能用于临床实践的是EGFR突变检测。目前多项研究结果显示，外周血进行EGFR突变检测，与组织标本的一致性约为59%～88%，灵敏性约为43%～82%，而特异性约为90%～100%。近期一项纳入了27项研究共3110例NSCLC病例的荟萃分析显示，外周血EGFR突变检测的敏感性和特异性分别为62%和95.9%。重要的是，外周血ct-DNA中的EGFR突变状态同样可以预测EGFR-TKI的疗效。这些研究结果提示外周血ct-DNA可用于EGFR突变的检测，而且假阳性的可能性很小。

虽然，外周血EGFR突变检测具有较好的特异性，但敏感性却不理想，故需要更加敏感的基因检测方法。既往的研究多采用基于PCR的方法，如测序法、ARMS法、DHPLC法以及PNA-CLAMP法，这些方法的检测限为0.01%～10%，敏感性为43.1%～65.7%。近期发展起来的基于数字化PCR平台的微滴数字PCR法和BEAMing数字PCR法具有更低的检测限（0.005%～0.01%）。Thress等通过检测38例入组AZD9291患者的EGFR敏感突变（19del和21L858R）以及耐药突变（T790M），对比分析了4种检测方法（ARMS法、COBAS法、微滴数字PCR法以及BEAMing数字PCR法）在组织和血浆ct-DNA中的敏感性和特异性。对于EGFR敏感突变，COBAS法、微滴数字PCR法以及BEAMing数字PCR法敏感性略高（86%～100%），但三者之间差异不明显；然而，对于T790M突变，微滴数字PCR法和BEAMing数字PCR法具有更高的敏感性（69%～71%），明显高于ARMS法（29%）和COBAS法（41%）；以上结果提示数字化PCR平台具有更好的敏感性。但是，伴随检测敏感性的提高，特异性却出现下降，微滴数字PCR法和BEAMing法检测EGFR敏感突变的特异性仅为83%和67%，明显低于ARMS法和COBAS法（二者均为100%），因此寻找二者之间的平衡点即显得尤为重要。虽然这些基于PCR的方法具有较好的临床可应用性，但主要针对单个或几个基因已知的突变检测。

随着越来越多的驱动基因的发现，仅检测几个基因变异是不够的，需要建立多基因检测平台，NGS为此提供了机会。NGS技术的检测限约为0.2%～1%，可以在保证敏感性的基础上检测尽可能多的基因变异。Couraud等利用NGS技术同时分析了107个血浆标本的多个基因（包括EGFR、ERBB2、K-Ras、BRAF以及PIK3CA），与组织标本相比，检测的敏感性为58%（43%～71%），特异性为87%（62%～96%）。近期Lebofsky等利用NGS技术检测了27例不同瘤种患者ct-DNA中的46个基因，涵盖6800个COSMIC热点突变，结果显示，转移灶中的29个突变有28个可以在ct-DNA中检测到。这些结果显示NGS技术用于ct-DNA多基因突变检测的可行性。

NGS技术不仅可以用于检测已知基因变异，更重要的是可以进行全基因组范围内的基因变异分析，包括基因突变、重排以及CNV，并可以发现未知的基因变异。Murtaza等动态分析了6例乳腺癌、卵巢癌、肺癌患者治疗过程中ct-DNA的外显子组结果，发现了可能与耐药相关的基因变异，例如：乳腺癌紫杉醇治疗过程中PI3KCA突变率增高，铂类治疗中的RB1突变，他莫昔芬、曲妥珠单抗治疗中MED1的突变增加，随后拉帕替尼治疗后出现的剪切变异GAS6以及肺癌EGFR-TKI耐药后出现的T790M突变，以上结果提示ct-DNA外显子组检测可以作为组织标本的一种补充替代。

Dawson等对30例经全基因组测序发现具有点突变或结构变异的晚期乳腺癌患者治疗过程中动态获取的ct-DNA进行了深度测序，发现ct-DNA中点突变或结构变异的定量、动态检测是更敏感的可预测疗效的分子事件。另外，基于基因组学分析建立的PARE法和数字化核型分析法可以用于分析血浆ct-DNA的基因重排及染色体拷贝数变异。这些基于NGS技术的基因组学分析无疑为外周血ct-DNA的应用敞开了通往远方的大门。

除可简单易行地用于基因分型外，ct-DNA另一个重要优势是可实现基因变异的动态监测。如前所述，利用NGS技术进行ct-DNA深度测序可以实现全基因组范围内的动态、定量基因检测，然而目前用于临床并不现实。

对于敏感和耐药基因相对明确的肿瘤类型，可以通过其他的方法实现基因变异的动态、定量监测，例如EGFR敏感突变（19del和21L858R）和耐药突变（T790M）。Sorenson等对23例接受EGFR-TKI治疗的EGFR突变型肺腺癌患者采用COBAS的方法动态监测EGFR突变的状态，发现EGFR敏感突变量随着EGFR-TKI治疗有效而逐渐降低，T790M含量随着疾病进展逐渐升高，而且血浆ct-DNA中可检测到T790M突变要早于临床耐药进展的344天。Oxnard等利用微滴数字PCR法同样实现了基因的动态、定量检测，该研究组检测了EGFR突变型肺癌患者厄洛替尼治疗过程中多个时间点的EGFR敏感突变（19del和21L858R）和耐药突变（T790M）状态，发现大部分患者EGFR突变含量与肿瘤负荷和EGFR-TKI疗效相关，而且耐药基因T790M的出现可能早于影像学进展16～32周出现。这些研究的结果提示耐药基因可能早于影像学进展出现，那么随着抗耐药基因药物的出现，确定最佳干预时机自然成为未来的研究课题。

ct-DNA面临的问题与挑战

目前，ct-DNA在基因检测方面已获很大的进展，但在广泛应用于临床之前，仍存在诸多问题与挑战。

第一，虽然大量回顾性研究显示外周血ct-DNA进行基因检测具有可行性，但无前瞻性研究进行验证，因此需要开展前瞻性临床研究才能为ct-DNA基因检测提供高级别的循证医学证据，才可能改写指南。

第二，检测方法不统一，缺少标准化流程。从基于PCR的技术到NGS技术，除了ARMS和COBAS法，其他检测方法并未形成标准化的流程。另外，各中心在样本处理以及病例选择、数据分析方面的差异导至结果的重复性欠佳。因此，我们需要进一步标化检测方法，尽可能减少人为因素带来的偏倚。

第三，虽然ct-DNA基因检测的特异性较好，但敏感性却不理想，如果提高敏感性，又可能导至特异性的下降。因此，选择合适的检测方法找到敏感性和特异性之间的平衡点是解决的办法。

第四，利用ct-DNA进行NGS的全基因组测序相比单基因检测平台的优势在于可以同时进行多基因甚至基因组分析，而且可以发现未知的基因变异。这要求更大量的ct-DNA输入量，但势必同时带来更多正常cf-DNA的干扰，如果提高测序深度，又会明显增加费用。因此，需要进一步研究如何提高ct-DNA纯度（如选择合适的采血时间点、寻找ct-DNA标定物），以及降低全基因组检测的费用等。

第五，由于肿瘤异质性的存在，局部组织穿刺标本很难用于基因变异的定量分析，但外周血中的ct-DNA可能反映肿瘤DNA整体水平，因此可以用于基因变异的定量分析。目前用于定量分析的方法很多，包括分光光度法、荧光染色法、实时定量PCR法及NGS技术等，但同样是缺乏标准化的流程、缺乏统一的与临床相关的定量数据，缺乏各定量方法间优缺点的比较，因此，基于ct-DNA的定量研究尚处于起步阶段。

如何选择CTC与ct-DNA

CTC和ct-DNA共同存在于循环血流中，均可在一定程度上反映肿瘤的生物学和基因学信息，二者在临床和科研应用方面各有特点，因此需要合理定位才能充分发挥二者的应用价值。

外周血最有前景的临床应用意义是可以通过无创手段实现基因信息的动态监测，血浆ct-DNA获取容易、操作简单、费用低廉，而且有较好的临床数据支持，因此在未来有可能被广泛应用于临床。

虽然CTC可以提供更纯的肿瘤DNA，但受分离技术及操作费用的限制，目前尚难以应用于临床。但CTC代表一种结构完整的细胞群体，可用于基于细胞体的形态学分析，如细胞病理学、免疫细胞化学以及荧光原位杂交等，这些技术可辅助病理诊断，而且可用于融合基因的检测如ALK、ROS1以及才c-MET等。虽然血浆ct-DNA也可通过实时定量PCR实现融合基因的检测，但是由于临界阈值难以确定，临床认可度较差。随着NGS技术的发展，通过CTC和ct-DNA均可实现全基因组的分析，但二者均存在缺陷。利用目前技术获得的CTC尚很难说可以代表全部的CTC，因此进行的基因组分析未必能反映整体的肿瘤基因组特点。从这一角度讲，血浆ct-DNA似乎更具优势，但由于血浆ct-DNA难以避免正常cf-DNA的干扰，导至基因组测序数据质量较差。

因此，无论CTC或ct-DNA，基因组测序尚不十分成熟，结果的解读也须谨慎。CTC被认为是导至血行转移的根源，因此是研究肿瘤转移机制的最佳切入点。另外，CTC作为功能性的细胞体，可以通过建立细胞系及动物接种模型进行药敏试验和新药开发，而这些是血浆ct-DNA无法完成的。总之就目前而言，血浆ct-DNA更可能在不久的将来广泛应用于临床实践，而CTC更多的是科研方面的应用价值。

总结

“液态活检”的概念以及其可能带来的广阔应用前景已经引起了世界范围内医学工作者的关注，基于外周血的生物信息分析和功能研究正在如火如荼地开展，近些年关于CTC和ct-DNA的文献发表量也相当大。但是，我们应该认识到，在这方面依然还有诸多未知的领域，故对于任何研究的结果均应全面考虑、谨慎判读。未来需要临床、科研及生物信息学专家共同合作，开展更多基于外周血的相关研究，才能使其得到更好的应用。

王洁教授简介

主任医师、博士生导师，北京大学肿瘤医院胸部肿瘤内一科主任，中国抗癌协会肺癌专业委员会常委，CSCO小细胞肺癌专家委员会副主任委员、北京医学会肿瘤专业委员会副主任委员。

来源：临床肿瘤学论坛杂志7月刊  作者：王洁