粪便检测在结直肠癌筛查中的进展

检验医师

粪便是反映消化道病变的一个常见窗口，消化道以外的肿瘤细胞一般不可能从粪便中排出。因此，粪便的检测在消化道疾病的诊断中有重要意义，尤其对结直肠癌的筛查，已成为国内外各学者研究的热点。新的方法，新的检测项目，新的项目组合的临床研究不断在发展中。

一、粪便潜隐血试验（FOBT）

粪便潜血通常是上消化道或下消化道内部慢性出血（通常是间歇性出血）导至的，粪便中的微量出血或检出血红蛋白是结直肠癌早期无特殊症状时异常现象。目前检测粪便中微量出血或血红蛋白的常见试验是粪便潜隐血试验。

化学法FOBT有两种检测方式，邻甲苯胺检测的敏感性较高，可检出0.2～1mg/L的血红蛋白，只要消化道1～5mL的出血，即可呈阳性反应，但此法需禁食3天，否则出现大量的假阳性；愈创木酯法较邻甲苯胺法敏感性低，原理是粪便样品中的血液使愈创木脂变为明显的蓝色。需6～10mg/L的血红蛋白，即20mL消化道出血，才可出现阳性结果，此法虽然不甚灵敏，但特异性高。国外研究表明，愈创木酯法的FOBT对结直肠癌的敏感性为26％～57％，对腺瘤为8％。国外有研究用此法对79岁人群随访，发现其FOBT阳性率7.1％，人群依从性可达95％，而且在阳性中发现3例结直肠肿瘤，此研究表明愈创木酯法在筛查结直肠癌的可行性。以上两种方法均使用简便、成本低，但易受食物或药物的影响而产生假阴性结果。据最新报道，美国胃肠道病学会推荐使用无再水愈创木酯试验可避免相关干扰，筛检出结直肠癌。

免疫学粪便隐血试验（IFOBT）是当前发展较快的方法之一，近年来发展迅速。有学者研究发现，结直肠癌在IFOBT中阳性率为94％。目前将免疫法中胶体金技术与单克隆技术结合的胶体金免疫层析法被学者大量研究，它在血红蛋白为0.2pg/mL时即可显阳性，并且这个方法简便、快速，基本排除饮食及药物等因素的干扰，被世界卫生组织胃肠镜检查协会推荐作为粪便潜血试验的一种较为确认的方法。但是，这个方法也存在一些问题需改进，如只定性不能定量，因而不能对消化道出血的病人进行疗效观察；另外有实验显示当标本血红蛋白量过多（>30000ug/mL），过低（<0.03ug/mL）时，此法结果均为阴性，只有血红蛋白在3～300ug/mL时才为强阳性，因此易存在假阴性结果。

在FOBT检测结直肠癌中，一次FOBT检测的敏感性仅为40％～50％，其应用价值有一定的限度，所以增加FOBT的检查频率，能够提高结直肠癌的检出率。国际上通用的结直肠癌筛检方法是连续3d进行粪便隐血试验。有类似的研究采用进行3次化学法或者免疫法FOBT的检测方法，计算两种方法的阳性次数，发现结直肠癌的CFOBT和IFOBT的比率高于2+和1+，阳性次数与腺瘤性息肉及结直肠病变类型有显著相关性，与癌变部位无相关性（P>0.05）。目前使用免疫化学法进行多次检测，可避免两种方法存在的短处，有研究显示，对有症状者进行这种方式的筛查，敏感性和特异性分别为76.5％和95.3％；另有研究发现，免疫化学法对无症状的结直肠癌患者也具有高的阳性率。

二、蛋白标志物检测粪便

蛋白标志物检测粪便结直肠脱落细胞蛋白是另一种很有发展前途的生物标志物，它包括钙卫蛋白、促衰变因子、热休克蛋白60等蛋白标志物。目前这些指标尚缺乏大系列人群对照研究，多数研究者仅对单一或数种指标进行研究。

粪便中的钙卫蛋白（CPT）主要来自组织中中性粒细胞的脱落而且对蛋白质水解会产生抵抗，不受反复冻融的影响，是一种重要的炎症反应性蛋白。而且粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白都直接与炎症过程相关，是一种粪便内可作为炎症指标的有用标志物。粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白在粪便内可以保持稳定的时长分别为7天和5天，易于测量。因此它们具有作为炎症性肠病（IBD）非侵入性标志物的潜在可能。粪便生物标志物在IBD的临床意义包括：IBD或非IBD的鉴别诊断，监视内窥镜检查以及临床病程及特点的预测。最新的系统评价已经确认：粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白能为IBD提供非侵入性且准确的诊断和监视方法。粪便生物标志物可避免使用侵入性放射性检查或者内窥镜检查，为治疗决策提供建议。不仅如此，粪便钙卫蛋白在预测没有症状的IBD患者的疾病复发方面也是非常有用的。

另外的一些研究证实，与常规炎症标志物如CRP和ESR、白细胞计数或血小板计数相比，粪便生物标志物与克罗恩病（CD）切除术后的内窥镜检查活动有更高的相关性。

结直肠癌肿瘤组织周边基质中往往有炎性细胞的浸润，故肿瘤组织的CPT浓度会有所升高，可作为肿瘤的标志物之一。粪便CPT判断肠道肿瘤的敏感性为79％～87％，超过了粪便隐血试验、红细胞沉降率、C反应蛋白等指标。近期有研究发现，90％以上的直肠癌患者粪便CPT含量均超过10mg/L，而待根治性切除术后，其含量可降至l0mg/L以下。因此CPT对结直肠癌的早期治疗有重要意义。钙卫蛋白通常使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测量。由于ELISA比较耗时，通常适用于批量样品的分析。因此，现在已经开发出来了更快更人性化的技术。床旁粪便钙卫蛋白测试已经上市，30分钟内可完成检测，更加迅速地得到测试结果，对临床来说是一个有益的帮助。

促衰变因子（DAF）是一种细胞膜结合糖蛋白，广泛存在于各种组织和细胞中。结直肠癌患者DAF在糖苷磷脂酰醇部位脱落进入粪便，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）可测到粪便中DAF含量。研究发现，患者检测2次DAF时敏感性为72％，特异性为92％，且TMNO期检出率为50％，I期53％，Ⅱ期76％，Ⅲ期77％，Ⅳ期85％，提示DAF检测可作为筛查结直肠癌的一个非侵入性的标志物。

热休克蛋白60（HSP60）又称伴侣蛋白。目前大量研究发现HSP60作为一种在所有细胞中表达的高度保守，具有保护作用的蛋白质在肿瘤分子标志、肿瘤预后、肿瘤治疗方面具有重要的作用，且在多种肿瘤中呈高表达。结直肠癌患者粪便中HSP60浓度明显高于血清中HSP60浓度，并且通过对粪便HSP60进行检测来诊断结直肠癌能获得更高的敏感度，提示HSP60在结直肠癌筛检方面有研究的价值。

端粒酶是一个肿瘤发生、发展过程中重要的分子生物标志物，它在正常组织中基本不表达，而在结直肠癌组织中呈高表达（80.8％～94.6％），因此结直肠癌组织中端粒酶检测在肿瘤早期诊断中的重要性已被大多数人认同。目前粪便中端粒酶检测尚缺乏大量研究。有学者研究报道，62.8％的结直肠癌患者粪便标本中有端粒酶阳性表达，且与患者结直肠癌Duke’s分期、淋巴结转移和癌肿部位均未见显著相关，并得出粪便端粒酶检测对结直肠癌的敏感性、特异性和阳性预测值分别达到62.8％、95.7％、96.4％，由此说明端粒酶检测对结直肠癌的早期诊断具有特殊价值；近两年有学者进一步研究发现，粪便中端粒酶反转录酶和生存素与组织中的表达一致，在结直肠癌中的阳性率分91.3％、50％。因此端粒酶可作为结直肠癌的早期诊断的一种非侵袭性的研究指标。

三、粪便的分子学检测

基因检测结直肠癌的发展是一个多阶段、多步骤的过程，是由于癌基因和抑癌基因的积累或DNA后天性改变引起的，它们可以单独或通过相互影响发挥作用。大量研究认为，粪便中的一些肿瘤相关突变基因，如KRAS、P53、APC等，有助于筛查出不同阶段的结直肠癌。

KRAS的同源基因有很多，而在结直肠癌中，突出表现在KRAS基因的突变上。KRAS定位染色体12p，主要在12、13和61密码子发生突变，属于结直肠癌发生的早期事件。关于粪便中KRAS基因的改变在结肠癌患者粪便中检测的报道逐渐增多，检出率为40％～90％；一项研究中报道了31例结直肠癌患者粪便KRAS基因扩增率为70％，癌组织中检测到KRAS突变9例，在相应患者粪便中检测到突变7例，敏感性为77％，特异性100％，优于FOBT；国内证实了PCR技术检测粪便中的KRAS突变体能真实反映结直肠癌组织基因的突变情况，为结直肠癌的早期诊断提供了分子检测手段。

APC定位于染色体5q21，属于抑癌基因，其突变可导至细胞内粘连蛋白降解障碍，引起上皮细胞异型增生，在结直肠癌的发生中属中期事件。但近年来的一些研究已经明确APC基因突变是结直肠癌的早期事件，因此检测突变APC基因可检出早期结直肠癌和腺癌。一个研究报道了在46名结肠癌和腺瘤患者检测突变36名。其中粪便中检测到突变APC基因的阳性率为57％；另外一个报道中，检测粪便中APC基因突变阳性率为37.75%，腺癌和结直肠癌APC基因突变分别为25％和80％，证明APC的检测有助于结直肠癌的早期诊断。

P53抑癌基因是结直肠癌中最常见的突变基因，其突变发生于5～8外显子，在结直肠癌的发生中属晚期事件。有报道40例结直肠癌患者组标本中29例存在P53突变，敏感性为57.5％，明显高于FOBT及癌胚抗原检测的阳性率；另有报道在40例结直肠癌患者组织标本中发现27例P53基因突变，其中粪便中28例，突变检出的敏感性为60％。因此粪便中P53的检测对结直肠癌的筛查有一定意义。

多基因联合检测癌症的发生是一个多基因改变的过程，结直肠癌的发生还有其它基因所引起，如DCC基因的缺失、DNA甲基化的丧失，错配修复基因种系突变等。检测粪便中单个基因具有较高的特异性，但敏感性较低。既使检测到粪便中含癌细胞，但是仅有50％患者表现阳性，部分所检粪便标本尚不含脱落癌细胞，造成粪便基因检测阳性率不高及客观上的假阴性。因此国内外越来越多的研究把重点放在FOBT阳性粪便样本中测量癌症相关生物标志物，进行多基因联合检测。区分基于FOBT筛查实验中的真阳性和假阳性，如在研究结直肠癌粪便DNA甲基化中，单个基因检出率较低，但联合检测后检出率高达96.2％。联合检测APC、KRAS、TP53、MSI、L-DNA，对结肠敏感性为64％，腺瘤敏感性为57％；KRAS、P53、APC基因联合检测，发现总体敏感性63％，腺瘤的敏感性26％；国内的一项研究认为P53和APC共同检测结直肠癌，其阳性率可达77.78％。以上总体差异反映了所测基因种类、样品处理、粪便中基因提取方法及所研究患者的差异。

另有研究说明，检测粪便、尿液或血清样品中的甲基化wif-1，在检测晚期肿瘤方面与FOBT相比，具有更高的准确度。

四、脱落细胞检测

正常肠黏膜每24h有1×10^10～5×10^10个上皮细胞脱落，肿瘤上皮细胞的更新速度更快，每天约有1％的细胞脱落入肠道，并随粪便排出体外。正常结直肠黏膜脱落的主要是凋亡细胞，而结直肠癌组织脱落的主要是大量细胞角蛋白免疫组化染色阳性的结肠细胞和炎性细胞，脱落结肠细胞仍保留有表达肿瘤相关抗原的特性，随着粪便脱落细胞分离收集技术的发展，检测粪便结直肠脱落细胞已成为目前非侵袭性结直肠癌筛检技术研究的热点。收集结直肠癌腹泻液，可检出癌细胞和不典型增生细胞；有学者用密度离心法提取粪便中脱落细胞，其提取细胞量达（0.75～1.2）×10^6/g，且80％以上为活细胞，进一步研究证实，此脱落细胞几乎都来源于结、直肠；有关学者在87例有临床症状患者中找到64例癌细胞或可疑癌细胞，对结直肠癌筛检的敏感性为75.56％，特异性为98.93％。因此，粪便脱落细胞检测具有早期发现病变、无创、患者依从性好等特点，在结直肠癌筛查上具有潜在的应用前景。

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其诊断虽有较大进展，但确诊时多已偏晚，影响预后，迫切需要敏感的早期筛查指标。目前国内外学者从粪便隐血、蛋白标志物、端粒酶、基因、脱落细胞等与结直肠癌的发生、发展密切相关的粪便检测的指标中进行深入的研究，相信随着人们对粪便检测更深入的认识和探究，可以根据检测粪便中一些敏感性更好的指标，并结合粪便特异检测指标，有望能在结直肠癌早期阶段做出正确的预测及诊断，并针对不同患者发病及病情演变的个体差异，采取不同的防治措施，及时给予个体化治疗，提高结直肠癌患者的治疗和预后水平。

来源：检验视界网