丁香园TomBacon老师的《胶体金试纸-标准实验操作指南》

numbrg

序
在海外学习的日子里，经常收到丁香园战友邮件，询问胶体金试纸的实验操作问题。于是计划编写一本标准实验操作指南，将实验过程以step by step方式呈现出来，方便战友们参考和开展实验。力求使用简单、明确的表达方式，达到看完就能开展实验的目的。同时希望大家就该指南提出宝贵意见和补充信息。另，我的英文名已改为Binz Smith，有兴趣的战友，可以在linkedin或facebook上找到我。

一，实验准备：

1. 仪器及用途：
biodot XYZ3060，定量喷点C/T线及胶体金溶液
电磁加热搅拌套式恒温器+洄流圆形烧瓶+蛇型冷凝管+搅拌子，烧金
分光光度计，测定金颗粒质量
高速冷冻离心机，标记过程用
烘箱（25度-65度），膜烘干
切条机，biodot CM4000
除湿机，干燥度20%
封口机，试纸保存

2. 耗材：
NC膜，whatman FF120 或 AE99
吸水纸，进口国产皆可
胶体金垫，聚酯膜 whatman Standard 14&17，或者 Ahlstrom 6613
样品垫，玻璃纤维whatman 33 glass，或者 Ahlstrom 8964
PVC背板，国产进口皆可

3. 试剂：
HAuCL4（进口，sigma），制金原料
柠檬酸三钠，制金原料
二氯二甲硅烷+氯仿，清洁制金玻璃容器试剂
BSA（进口，巴斯夫或sigma），标记添加剂
PEG 20000，标记添加剂
精密pH试纸（whatman），标记溶液PH调节
各种普通化学药品，表面活性剂，缓冲溶液若干

4. 抗原抗体材料，自备

二，抗原抗体的前处理和保存

1. 腹水的纯化：饱和硫酸铵沉淀法或辛酸沉淀法, 然后过亲和层析柱（必须）。

2. 蛋白浓缩：冷冻抽干，或透析

3. 蛋白的测定：
1）纯度测定，跑Pag胶，测定条带大小及完整性，看是否有杂带析出。
2）浓度测定，分光光度计使用280nm，260nm波长测OD。

4. 蛋白保存：
1）将大容量的抗体分装成大瓶和小瓶两种，以免反复冻融和避免污染，可加0.05%叠氮钠防腐。
2）短期保存，4度低温冷藏，蛋白活性可保持数周。
3）长期保存，-70度低温冷冻. 注意复融时，请遵守（-70度）至（-20度）至（-4度或0度）至（常温）的多级降温程序。温度跨度过大容易失活，产生蛋白沉淀。

5. 标记前处理：
1） 离心去杂质沉淀
2） 如蛋白是使用饱和硫酸铵沉淀法等盐法提纯，需使用2mM硼酸PH9.0或者是10mM的PB缓冲溶液PH7.4进行透析，将溶液内的盐充分透析出, 盐将影响标记效果。

三，金溶液制作

1. 玻璃容器的清洁
玻璃表面的污染会干扰金颗粒的生成，所有玻璃容器使用前经过酸洗硅化。
方法是将初次使用的玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。反复使用的器皿以金溶液润洗后双蒸馏水淋洗，代替硅化处理。

2. 金颗粒制备
注意：该以下过程为化学反应，金颗粒效果取决于化学原料的质量，请使用进口药品。

原材料：
1% HAuCL4（sigma） 溶液
HAuCL4易受潮且对金属有强腐蚀性，因此称量时，勿用金属药匙，避免接触天平称盘。稀释方式为双蒸馏水（电阻率18.2左右），其溶液在４℃可稳定数月。
1% 柠檬酸三钠溶液（sigma），需新鲜制备，然后0.22um滤膜过滤

仪器： 电磁加热搅拌套式恒温器+洄流圆形烧瓶+蛇型冷凝管+搅拌子

方法：
1) 取99 ml ddH2O于洄流圆底烧瓶中，加入1ml 1% HAuCL4溶液，混匀。
2) 洄流圆底烧瓶置于电热套式恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾。
3) 迅速一次性加入1ml 1% 柠檬酸三钠溶液，继续煮沸。
4) 观察溶液颜色变化，由浅黄→黑色→紫色→紫红色，当完全变为紫红色时，继续洄流10分钟。
5) 停止加热，冷却至室温。

注意：可通过调整柠檬酸三钠溶液的加入量，来控制金颗粒大小。

3. 金颗粒检测

仪器：分光光度计

方法：
1）设定500-550 nm扫描。
2）用ddH2O调零，后取金溶液，在500~550nm之间扫描吸收值。
3）要求在532nm±2nm（40nm）522nm±2nm（30nm）附近有最高吸收峰。

4. 金溶液pH调节

1) 配制1%K2CO3溶液
2) 用1%K2CO3调节金溶液pH至8.2（单抗标记），可调范围7.4-9.0。最佳标记PH以NaCL滴定法判断。
方法：滴加K2CO3到金溶液，边加边搅拌，whatman精密pH试纸检测到溶液pH值至8.2左右。如用pH计检测，则需精密防腐蚀电极，注意普通电极易吸附金颗粒导致堵塞损坏。

补充观点：
沧海一粟8312：个人觉得还是不要用pH试纸，因为这个靠肉眼判断肯定会有色差，以后批间差会很大。我觉得好的方法还是比如1ml的金水中加入2ul的0.1M k2co3的量，当然这个k2co3的量可自行调试，可以多弄几个梯度看看，关键还是看哪个用量是最佳的，然后放大。

四，抗体的金标记

1. 标记
标记量：双抗体夹心法10-20ug/ml，竞争法1-5ug/ml

1） 量取100ml金溶液，逐滴加入1mg抗体溶液，搅拌30分钟。
2） 取10% BSA, 逐滴加入混合溶液，至终浓度0.5%，搅拌15分钟。BSA作用为封闭非特异性位点和增加稳定性。
3） 取5% PEG(20 000)，逐滴加入混合溶液，至终浓度0.1%，搅拌15分钟。

2. 离心纯化

仪器： 高速冷冻离心机，

操作步骤
1）离心，速度8000-9000RPM，4℃，1小时
2）悬浮沉淀弃上清，后加入稀释液混匀。 稀释比例根据原液量换算，例100ml原液，沉淀稀释到10-20ml。Buffer （pH7.2-8.2）可用PBS等。

3. 金标抗体的检测

仪器：分光光度计

检测：
1）以稀释液为空白对照
2）扫描金标抗体在500~550nm间吸收值，抗体标记后峰值变化3-5nm.

注意：标记溶液应即标即用，不宜长期存储。

五，胶体金垫与样品垫的预处理

1. 确定处理数量，A4纸张（或裁切成其他规格），每10张一叠放置。
2. 配置缓冲液（约30ml/A4纸张大小）。因材料厚薄和性能略有差异，处理液量需灵活调节。处理液配方请根据具体产品准备，基本元素：缓冲buffer+NaCl+表面活性剂+大蛋白（BSA, Casein）+其他。
3. 带手套, 将材料放入缓冲液完全浸透，浸泡10min，后取出脱水3min，平置在筛网上.
4. 放入37℃干燥箱（湿度小于20%），烘干至湿度恒定在20%左右。
5. 将烘干后材料装入铝箔袋或塑料袋中密封保存，贴标签及记录批号，注意处理好的玻璃纤维不能长期暴露在湿度高的环境。注意，使用前要弃除四个材料边缘，因有边缘效应。

六，点样

1. 胶体金喷点到胶体金垫

1）稀释标记胶体金至5 OD/ul（浓度可自行调节），添加(终浓度): 10-20%蔗糖，1-3%BSA，0.5-1% NaCl, 0.5-1%表面活性剂.
2) 在湿度20－40％, 室温条件下，将溶液用BIODOT仪器的AIRJET喷头喷到胶体金垫上，压力设置为10 PSI，喷点参数为 2-6 ul/cm。
3) 将喷好的胶体金条带置于37℃干燥, 湿度恒定在20%后，收起并密封贮存。
4) 使用时切割整条条带即可，注意金条带两端边缘要弃除，因有边缘效应。

2. 抗原/抗体喷点到NC膜

1) 取出NC膜，在室温和正常湿度下平衡1小时。
2) 用缓冲溶液将抗原/抗体稀释到合适浓度（0.1-5mg/ml），缓冲系统可选磷酸盐, Tris, 碳酸盐；pH范围：6.0-9.0(根据等电点而定)，另加1%NaCl ，1%蔗糖，表面活性剂若干。
3) 使用BIODOT仪器，设定喷点量为0.5-1ul/cm，并点样。
4) 烘箱干燥，37度2小时至湿度20%以下，后密封包装待用。

注意：NC膜点样前不做任何处理。

七，试纸条的组装、剪切、包装（环境要求：常温，20%湿度以下）

1. 将NC膜非点样面粘贴于PVC底板.
2. 胶体金垫粘贴在NC膜的下方，覆盖NC膜1mm.
3. 吸水垫粘贴在NC膜的上方，覆盖NC膜2mm。
4. 样品垫粘贴在胶体金垫的下方，覆盖胶体金垫2mm
5. 在BIODOT，CM剪切机中将粘贴好的检测板剪切成4mm宽的条。
6. 装壳并和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签

后记
该文章的目的是建立胶体金试纸的基本工作流程，所以在应用上具有一定的局限性。希望大家在这个基础上添砖加瓦，不断将该流程丰富起来，使其成为一个更加完整的SOP操作指南。

（全文完）Binz Smith, in Perth, Australia. Nov 2012.

幸福侠侣

好帖，谢谢分享。丁香园常去。

numbrg

恩，丁香园最近帖子不多，我经常搜以前的帖子看，收获不少。

gloomyheart86

技术贴支持一下，丁香园还是不错的

richer1314

技术贴支持一下，顺便积分拿走:lol

涩涩的茶

丁香园作为专业的医学、药学、生命科学论坛，对医药行业的贡献是有目共睹的！

从2005年-2009年，是胶体金技术的快速发展期，这期间在DXY免疫测定与诊断技术版块中涌现出一大批专业人士，使该技术的交流热情空前高涨，为该技术的发展和推广做出了卓越的贡献，很多初学者都是在丁香园成长起来的。

TomBacon是很早一批致力于胶体金技术推广的人之一，其发表过的帖子亦有很多可圈可点之处，特别是对于初学者，帮助很大。

小桔灯作为IVD综合群的延伸和补充，致力于打造专业的IVD论坛，相信在大家的支持和共同努力下，小桔灯能对IVD行业有所贡献。

涩涩的茶

笔者将借花献佛，针对这个转帖与大家分析讨论，不断补充完善，以其对初学者有所帮助。

numbrg

版主多多发言，大家共同讨论，希望小桔灯能热闹起来。
总感觉现在的丁香园讨论贴少，而且前几年那些老人少了，回答问题的人也少了。

小白5809

技术贴支持一下，坐听各位大师分析讲解

莺歌燕舞

涩涩的茶 发表于 2013-2-21 09:33
丁香园作为专业的医学、药学、生命科学论坛，对医药行业的贡献是有目共睹的！

从2005年-2009年，是胶体金 ...

支持版主把本版建设为小桔灯的精品版块！:D

涩涩的茶

numbrg 发表于 2013-2-21 09:54
版主多多发言，大家共同讨论，希望小桔灯能热闹起来。
总感觉现在的丁香园讨论贴少，而且前几年那些老人少 ...

之前那些活跃的人，一部分转行了；一部分成了企业的中流砥柱，平时很忙；一部分自己开创事业了，不太方便跟大家交流了；一部分有所懈怠了，对于新人反反复复提到的一些问题，提不起兴趣，只是偶尔出来逛逛而已；还有一部分科研院校的，毕业后不再从事这块······

jingdo

技术贴一定要多支持，多学习学习！希望小桔灯越来越繁华

涩涩的茶

分步讨论分析

1. 仪器及用途：
biodot XYZ3060，定量喷点C/T线及胶体金溶液
电磁加热搅拌套式恒温器+洄流圆形烧瓶+蛇型冷凝管+搅拌子，烧金
分光光度计，测定金颗粒质量
高速冷冻离心机，标记过程用
烘箱（25度-65度），膜烘干
切条机，biodot CM4000
除湿机，干燥度20%
封口机，试纸保存

关于喷金、喷膜/划膜设备，BIODOT一直是业内的佼佼者，仪器精度很高，程序设计非常人性化，操作流畅，但在实际应用过程中，发现BIODOT的喷膜模块经常出问题，其受专利保护的电子阀非常脆弱，对于少量溶液的喷涂效果也比较差。因此对于免疫层析，个人比较推崇其划膜设备。
BIODOT的设备是比较贵的，{:1_143:}  国产的喷金划膜设备性能也还可以，精度和程序设计方面逊色一些，但是价格便宜很多。

电磁加热搅拌套式恒温器+洄流圆形烧瓶+蛇型冷凝管+搅拌子，对于小批量烧制胶体金，是比较理想的选择,无需再定容。

至于用分光光度计测定金颗粒的质量，其实效果并没有预期的那么理想，有时候肉眼观察有颜色差异的两瓶金子，分光光度计测不出差别。

高速冷冻离心机，最高转速需要达到14000rpm

关于干燥，干燥方式包括：烘干、晾干、抽干、冻干，不同的干燥方式对应不同的干燥设备。

关于切条机，BIODOT的切条机真心很贵的说，国产的切条机还是很不错的。{:1_143:}

其他设备，暂不讨论。

幸福侠侣

涩涩的茶 发表于 2013-2-23 17:12
分步讨论分析

1. 仪器及用途：

{:6_236:}，茶很厉害滴说。

莺歌燕舞

幸福侠侣 发表于 2013-2-23 18:48
，茶很厉害滴说。

{:6_235:}好帖一定要顶起来。

numbrg

涩涩的茶 发表于 2013-2-23 17:12
分步讨论分析

1. 仪器及用途：

某文献总结：“分光光度计扫描胶体金质量：最大吸收波长对应胶体金粒径，颗粒越大，最大吸收峰右移；最大吸收峰OD值对应分散状态，一般0.9以上合适，小于0.5表明胶体金大量团聚；峰宽对应粒径均匀度，峰形越细颗粒大小越均匀，标准差越小。”

涩涩的茶

某文献总结：“分光光度计扫描胶体金质量：最大吸收波长对应胶体金粒径，颗粒越大，最大吸收峰右移；最大吸收峰OD值对应分散状态，一般0.9以上合适，小于0.5表明胶体金大量团聚；峰宽对应粒径均匀度，峰形越细颗粒大小越均匀，标准差越小。”

理论上来讲是这样的，但实际应用的时候，达不到预期效果。

涩涩的茶

分步讨论分析

2. 耗材：
NC膜，whatman FF120 或 AE99
吸水纸，进口国产皆可
胶体金垫，聚酯膜 whatman Standard 14&17，或者 Ahlstrom 6613
样品垫，玻璃纤维whatman 33 glass，或者 Ahlstrom 8964
PVC背板，国产进口皆可

NC膜 可选择的品牌还是比较多的
whatman  millipore Sartorius  Paul  MDI ·······
AE99 是whatman 比较经典的一款NC膜
millipore  135  180  
Sartorius  CN140 性能都是很不错的·······
个人比较钟情Sartorius  CN140   操作方便 性能稳定 性价比高  
AE99 没有背衬 很脆弱 操作起来 不是很方便
millipore 的NC膜 保质期太短  长时间放置 很容易酸化降解

金垫建议选择结构致密、均一、厚度适中的材质，个人比较喜欢Ahlstrom 8964

PVC板   条式的可选择厚点的PVC板，韧性大一些。生产操作过程中，不容易被弯折；卡式的可选择薄一点的PVC板，可塑性好。

numbrg

请教版主一个问题，有些产品划膜干燥后NC膜上能看到明显的蛋白印迹，有点发黄，类似与NC膜老化，是不是某些划膜成品夺了NC膜的间隙水，加速了NC膜的老化？倒是对性能没有太大影响，但是外观上有点说不过去。

fengsy

努力赚钱中，争取早日浏览更多内容！