立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

小桔灯网

图文播报

查看: 3237|回复: 3

[分享] IHC/ICC 免疫组化实验方案之难点解决方法

[复制链接]
发表于 2014-4-9 16:37:23 | 显示全部楼层 |阅读模式

登陆有金桔奖励并可浏览全文!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册 微信登录

x
本帖最后由 univbi 于 2014-4-10 14:13 编辑


设计一个成功的IHC/ICC实验
上海优宁维生物科技有限公司
   
       R& D Systems位于细胞生物学行业领先地位,2009年NATURE系列刊物就有790篇论文使用R&D Systems的产品。高质量的IHC抗体不仅提供低背景高信号的染色结果,而且可以反映组织生理学的真实结果。R&    D Systems抗体交叉反应低,特异性高,保证了真实可靠的信号结果。
1. R&D Systems一抗的质量如何?
          为保障实验结果的可靠性,使用低交叉反应的高品质抗体。RD抗体主要采用活性重组蛋白作为免疫原,而不是人工合成的多肽。IHC/ICC抗体经过实验多重筛选及不同组织测试,避免了由于抗体的品质问题而导致的科研人员时间与样本的浪费,保证了真实可靠的信号结果。
   
2. R&D Systems一抗IHC应用区分石蜡和冰冻切片吗?区分IHCICC吗?
          R& D Systems抗体经过不同的细胞及组织材料的筛选,能特异性识别石蜡和冰冻切片中的抗原,IHC和ICC相互通用。
   
3.IHC/ICC, 选择单抗还是多抗?
          单抗和多抗的固有特性决定了其优劣势。单抗,由单个B细胞克隆产生的,具有高亲和力和针对单个抗原表位的特异性。如需检测具有相同氨基酸序列的蛋白家族,单抗就非常适合。单抗和抗原结合的效果取决于抗原能否保持其天然构象。但是抗原的构象一旦由于各种原因发生改变,如由于蛋白相互作用,翻译后修饰,温度,pH,固定,盐浓度等,单抗和抗原结合的效果会受到严重影响。
   
      由于多抗可以识别多个表位,不太受蛋白质构象变化的影响。一般来说,在一定的pH值和盐浓度范围内,多抗也比单抗更加稳定。基于这些原因,多抗比单抗更适合IHC/ICC实验。与其他公司多抗不同,R& D Systems有一类经抗原亲和纯化的多抗(货号以AF开头),该多抗通过抗原亲和柱的纯化提高了特异性,更加适合IHC/ICC实验。
   
   
      
      
   
   
4.一抗试剂的孵育条件?一抗浓度,温度,时间?
          一抗抗体浓度,稀释,孵育时间和温度都会影响染色质量。这些变量需要针对不同抗体和样品进行优化,以达到高特异性,低背景的信号。一般的优化过程是,保持固定的孵育时间和温度,同时改变抗体的浓度以决定最佳的低噪音背景的信号。例如,使用一只高亲特异性抗体,可以使用相对较高的抗体浓度配套较短的孵育时间;或者,相对较低的抗体浓度配套较长的孵育时间。为促进特异性染色,常选用较长的孵育时间及较低温度下进行(如室温和4°C)。
          R&D Systems的染色优化方案: 对于组织切片,起始优化条件是4°C孵育过夜; 对于染色细胞,起始优化条件是室温孵育1小时。经抗原亲和纯化的多抗 (1.7-15 ug/mL) 较单抗(5-25 ug/mL)的工作液浓度低。如使用不同浓度的同一抗体比较样本的染色效果,孵育时间和温度一定要一致。在实验室中使用新抗体时,建议进行预实验测试教广的抗体浓度。
   
   
      一抗孵育的起始优化条件         

  
样本

抗体
单抗
多抗
组织
5-25 ug/mL,4°C孵育过
1.7-15 ug/mL,4°C孵育过
细胞
5-25 ug/mL,室温孵育1小时
1.7-15 ug/mL,室温孵育1小
优势
单抗原表位特异性
工作浓度低

劣势
易受抗原表位的变化影响
非特异性高,需经过抗原亲和纯化

   
   
5.做石蜡切片IHC,推荐什么抗原修复技术?
          背景知识:日常工作中所使用的10%福尔马林固定的石蜡包埋组织,经常产生蛋白交联反应遮蔽了组织内某些蛋白抗原,阻碍了抗原与抗体的结合。为了打开蛋白间的交联,使被封闭的抗原充分暴露,抗原修复技术在免疫组化操作过程中是个极其重要的环节,不同抗原修复方法直接影响免疫组织化学染色结果的表达。
   
      R&D    Systems建议客户采用热修复的方法,并提供了高度优化的抗原修复试剂,有效修复抗原并提高免疫反应的效果:碱性抗原修复液(Catalog    # CTS013), 酸性抗原修复液    (Catalog # CTS014) ,中性pH    7.0抗原修复液(Catalog    # CTS015) ,含有前3种修复液的综合修复液 (Catalog # CTS016)。在R&D Systems的实验室中, 我们发现使用碱性抗原修复    (Catalog # CTS013)容易取得良好的修复效果。
   
   
      
抗原未修复
      
      
抗原修复后
      
      
      
      
人小脑组织Neuroplastin 65
      一抗:3 μg/mL goat anti-human/mouse Neuroplastin 65      polyclonal antibody :Catalog # AF5360
      抗原修复:Antigen Retrieval      Reagent-Basic (Catalog # CTS013).
      染色:Anti-Goat HRP-DAB Cell & Tissue Staining Kit      (brown, Catalog # CTS008) and counterstained with hematoxylin (blue).
      
   
   
   
6.如何做对照?
          合适的对照对解释IHC/ICC的结果的真实性是至关重要的。一个令人满意的IHC/ICC实验设计会有力显示抗原位于正确的特定组织,细胞类型,或亚细胞位置。我们推荐:Endogenous Tissue    Background Control,No Primary Antibody    Control,Isotype Control,Absorption Control,Tissue Type Control。

   
7.IHC,如何避免非特异性染色?如何选择染色试剂盒?
          所有IHC/ICC研究具体取决于抗体抗原结合,由疏水作用,离子相互作用,氢键结合以及其他分子间作用力等控制。然而,同样的引力也可能导致非特异性染色,即一抗结合了抗原表位以外的氨基酸。这是在IHC/ICC中是一个常见的问题。我们面临的挑战是减少非特异性相互作用,而不影响抗体的抗原表位结合。

           非特异性染色的原因包括一抗和二抗与和血清蛋白的相互作用,抗体和组织间的离子相互作用,能影响IHC检测系统的内源性分子的相互作用。这些问题可能导致高背景从而无法观察到目标蛋白的表达位置。通过使用阻断剂(a    blocking reagent),可以修正非特异性染色体,而这些修正步骤都必须在一抗孵育之前完成。

优点
        
  • 即开即用
  • 高检测灵敏度
  • 适合冰冻切片,石蜡包埋切片,悬浮细胞等,
  • 适合细胞涂片(cytospin)(如淋巴细胞,单核细胞,转染细胞)
  • 适合多种一抗,如goat, mouse, rabbit, rat, sheep IgG.
组分
  
  • 4种封闭试剂(过氧化酶, 亲和素,生物素, 血清)
  • 高特异性生物素二抗
  • 高灵敏链酶亲和素HRPHS Streptavidin-HRP)
  • DAB (褐色) or AEC (红色) 染料和缓冲液
楼主热帖
回复

使用道具 举报

发表于 2014-9-29 11:12:54 | 显示全部楼层
昨天刚听了公司技术的报告,感觉很有经验的样子。
回复

使用道具 举报

发表于 2014-9-29 11:13:39 | 显示全部楼层
应该是王卓博士的演讲。
回复

使用道具 举报

 楼主| 发表于 2014-10-20 11:46:02 | 显示全部楼层
回复

使用道具 举报

发表回复

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册 微信登录

本版积分规则

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

快速回复 返回列表 客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
快速回复返回顶部 返回列表