干货分享 | 如何构建慢病毒稳定转染株? —— 附实验室祖传操作指南_MedChemExpress(MCA中国)

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你的基因还在玩"闪现"？慢病毒稳转株构建指南，让外源基因在细胞里安家落户，传 100 代也不丢！这把稳了

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为什么选慢病毒构建稳转株?

慢病毒 (Lentivirus) 载体是以人类免疫缺陷 1 型病毒 (HIV-1) 为基础开发的一种安全高效的基因治疗载体。它的“黑科技”在于：可将外源基因稳定整合到宿主细胞基因组，即使细胞分裂传代，也不会丢失，从而实现目的基因的长效、稳定表达。正因如此，慢病毒载体是构建稳定表达细胞株的理想工具。

表 1. 病毒特点及适用范围——慢病毒高频整合绝技，碾压其他病毒类型

名词解释：

• TU/mL (Transducing Unit/mL)：用于慢病毒，表示能有效感染细胞并表达外源基因的病毒颗粒数。

• PFU/mL (Plaque Forming Unit/mL)：用于腺病毒，表示能形成感染斑块的病毒颗粒数。

• VG/mL (Viral Genomes/mL)：用于腺相关病毒 (AAV)，表示病毒基因组数浓度，包括有功能和没有功能的病毒颗粒，不完全代表感染活性。

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三步搞定！

慢病毒稳转株构建指南

Step 1：载体构建——设计“基因快递单”

图 1. 慢病毒载体示意图。

一、载体元件选对，后续筛选更轻松，事半功倍不是梦

• 真核抗性基因 (Puromycin/Blasticidin 等)：抗性筛选“生死局”，未整合细胞全军覆没！
  
  

• 荧光蛋白 (GFP/mCherry 等)：肉眼实时追踪荧光表达，拒绝“盲筛”！
  
  

• 表位标签 (HA/Flag 等)：专属标签抗体检测，WB/IP 验证没烦恼。
  
  

二、明确实验目的，精准选载体

• 基因过表达，推荐载体如 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE，高效表达。
  
  

• 基因敲低，推荐载体如 pCLenti-U6-shRNA-CMV-Puro-WPRE，Knockdowm 稳准狠。
  
  

• CRISPR 编辑，推荐载体如 pLenti-U6-spgRNA-CMV-EGFP-WPRE，基因编辑快又准。
  
  

实验小妙招：

• 基因 > 4 kb，滴度可能暴跌 → 先做小试包装验证

• 抗性浓度过高，细胞团灭 → 务必预试浓度梯度！

• 荧光标签淬灭，传代后信号消失 → 早冻存早平安

• 表位标签掩蔽，蛋白折叠藏标签 → 改用柔性接头 (G4S) ×3

Step 2：慢病毒包装及收集——病毒“爆产能”

*以 10 cm 细胞培养皿为例。

图 2. 慢病毒包装实验流程图。

一、准备待转染细胞

转染前一天，将 4-6 × 106 个细胞 (293、293T 等) 接种至 10 cm 细胞培养皿中培养，使其在包装时密度为 70%-80%。

注：为提高病毒包装效率，建议使用生长状态良好且生长处于指数期、存活率 > 90% 的细胞进行慢病毒包装。

二、慢病毒包装 (转染)

1. 取 4 μL 慢病毒包装辅助质粒混合物至 2 mL 离心管中，加入 4 μg 含有目的基因的慢病毒载体质粒，轻柔混匀，加入 40 μL MCE Lentivirus Transfection Reagent  与质粒混合，室温孵育 3 min。

注：通常情况下，转染复合物中 DNA (total μg) 与 MCE Lentivirus Transfection Reagent (μL) 的比例为 1:2.5。为提高转染效果，可在 1:1-1:5 范围内调整以优化转染效果。

2. 加入 1.8 mL 无血清基础培养基，轻柔混匀，室温孵育 30 min，即形成转染试剂-核酸复合物。

注：转染试剂—核酸复核物在室温下 4 h 内保持稳定。

3. 将转染试剂-核酸复合物 (1.8 mL) 逐滴均匀加入细胞中，轻柔混匀，置于 37°C 5% CO2 培养箱中培养。

注：注意在滴加时缓慢，避免将细胞冲起，需轻柔混合均匀。

三、收病毒

1. 转染 24 h 后，弃去初始病毒上清液，加入 10-15 mL 新鲜的完全培养基 (含血清)，置于 37°C 5% CO2 培养箱中继续培养。

2. 转染 48 h 后，收集病毒上清液，再加入 10-15 mL 新鲜的完全培养基 (含血清)，置于 37°C 5% CO2 培养箱中继续培养。

3. 转染 72 h 后，观察细胞状态并拍照，并收集病毒上清液，与 48 h 收集的上清液混合，800 × g 离心 10 min 以去除细胞碎片，使用 0.45 μm 滤器过滤，过滤后的上清液可直接感染目的细胞，或对其浓缩以获得更高滴度的慢病毒浓缩液。

注：冻融一次的病毒滴度将降低 10%-20%，慢病毒建议分装后保存于 -80°C，并于半年内使用，切忌反复冻融。

四、慢病毒滴度检测分析

使用梯度稀释法感染细胞，采用 PCR、qPCR 等方法测定病毒滴度。

Step 3：慢病毒感染靶细胞

以 Puromycin 抗性筛选为例

* MOI 值至关重要！不同细胞最佳 MOI 值不同，强烈建议预实验摸索。

MOI (Multiplicity of Infection)：感染复数，即感染时病毒颗粒数与细胞数的比值。通常以达到约 80% 感染效率的 MOI 值为佳。

图 3. 慢病毒构建稳定细胞株流程示意图[1]。

一、预实验：确定细胞最低致死浓度 (Puromycin Kill Curve)

1. 将培养好的靶细胞传至 24 孔板。

2. 配制 Puromycin  母液 (1 mg/mL)，按下表定量加入 24 孔板细胞中。

3. 48 h 后细胞全部死亡的浓度即为靶细胞的 Puromycin 筛选浓度。

二、预实验：测定感染靶细胞的最佳 MOI 值

1. 接种细胞：实验前一天在 96 孔培养板中接种生长状态良好的细胞，每个孔内接种 0.5～1E+4 个靶细胞，铺板时的细胞融合率为 40% 左右，每孔培养基体积为 100 µL；进行病毒感染时细胞的融合度约为 70% 左右。

2. 稀释慢病毒：从 -80℃ 冰箱取出病毒，放冰上融化。取适量病毒原液，加 PBS 或无血清培养基稀释至 1E+8 TU/mL，剩余病毒 4℃ 保存。

3. 感染细胞：根据细胞数目、MOI 值以及病毒滴度，计算慢病毒感染细胞时所用病毒量，公式为：病毒加样量 (µL) = (MOI*细胞数目)/病毒滴度 × 1000。

下面以 MOI 值为 1、10、20、50、100，病毒滴度为 1E+8 TU/mL，计算病毒感染细胞所用病毒量，如表 2 所示。病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，观察细胞状态，若细胞状态良好则加入计算好的病毒液，轻轻混匀。混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5% CO2）孵育过夜。

表 2. 1E+8 TU/mL 病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考

               

4. 感染 24～48 h 后，换新鲜培养液，并加入预实验 1 所测的 Puromycin 最低致死浓度筛选阳性细胞。培养 3～5 天，期间根据细胞生长状态及时更换新鲜培养液，显微镜下观察，选取细胞存活率较高且细胞状态较好的孔，对应为较适宜的 MOI 值。

三、正式实验：稳定株筛选

• 确定最佳感染条件 (Puromycin 最低致死浓度、MOI 值) 后，即可放大正式实验。
  
  

• 放大原则：保持细胞初始接种密度不变，按比例放大培养基体积和病毒用量 (基于预实验细胞数与正式实验细胞数的比例)。
  
  

1. 按实际需要将细胞铺板，细胞数以第二天密度约 50% 为宜，37℃ 培养过夜。

2. 感染前，从 -80℃ 冰箱取出慢病毒，放冰上融化。加 PBS 或无血清培养基稀释至所需浓度，用枪吹打均匀。

3. 感染前给细胞换液，然后向每孔中均匀滴加稀释好的病毒液，轻轻摇匀，37℃ 培养过夜。

4. 感染 24 h 后，用 Trypsin 分离细胞并以低密度重新接种。接种 3 h 后，在培养基中添加 Puromycin 筛选阳性细胞。第二天换新鲜培养液，而后每隔一天进行一次细胞传代，维持 Puromycin 浓度。

5. 挑取由单细胞扩增形成的群落进行细胞扩增，并继续施加 Puromycin 进行维持性筛选培养。继续扩大培养。扩增完毕后 Western blot 或 PCR 或其他方式检测目的基因的表达。挑取鉴定结果较好的稳定细胞株，冻存保种。

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[1] Tandon N,et al. Generation of Stable Expression Mammalian Cell Lines Using Lentivirus. Bio Protoc. 2018 Nov 5;8(21):e3073.