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总结一下IVD行业的检测平台(一)——ELISA、化学发光

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发表于 2024-8-31 18:49 | 显示全部楼层 |阅读模式

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作者:知乎
疫情结束后,IVD行业逐渐回到正轨,国内法规也在逐渐规范,总的来看,国内的IVD行业虽然内卷,但仍然向荣。
最近工作中交流中发现很多做IVD研发的小伙伴还不熟悉这个行业的一些技术平台及相应的原理,趁着最近时间充裕,在这里总结一下吧。由于能力有限,难以避免出现漏误,欢迎指出,共同进步。
一、ELISA(酶联免疫)

      1971年,Engvall等人将免疫组化的EIA(酶免疫分析)技术应用于靶蛋白检验,并发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,ELISA技术由此诞生。ELISA是酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的简称,目前已被广泛应用于生物学、医学科学等多种研究领域。
      ELISA法原理:利用抗原抗体的特异性反应,结合酶对底物的高效催化作用,来检测靶蛋白的含量。实验时,需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上,通过检测分子(酶或荧光基团),将化学信号转换为电信号,以OD值或发光值的结果,对靶蛋白进行定量分析。
根据方法学的不同,ELISA分为:双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法
原理如图所示:



ELISA方法学原理图

图中未展示捕获法原理图。捕获法原理与间接法较为类似,只是二抗更换为抗人IgM抗体。
如果想要了解更为详细的内容,油管视频可以看看。
https://youtu.be/ouHZep5ofW8
二、CLIA(化学发光法)

化学发光技术是结合了化学发光系统和免疫反应,通过化学反应产生光子,进而检测待测物的一种方法学。由于化学发光技术具有灵敏度高、精密度好、设备简单、操作方便、线性范围广、分析快、也便于实现自动化等优点,目前已广泛用于临床检测、食品安全、生命科学等领域。
化学发光技术总的来说是基于超顺磁性磁珠、发光底物、免疫学反应以及自动化仪器实现待测物质的检测。这里简单以一步法为例,做一个说明。这里的磁微粒的主要原料是四氧化三铁,具有超顺磁性,施加外磁场表现出磁性,撤除外磁场磁性消失。



一步法检测待测抗原原理

根据试剂测试待测物质时,需要清洗几次,分为了一步法、两步法、三步法等(这里不做详细解释,后续会出相关文章解释)。
根据不同的发光原理,大致可以分为以下类(这里对直接化学发光和间接化学发光不做区分,有兴趣了解的可以私信或评论):
1、碱性磷酸酶平台(ALP)
该平台属于间接化学发光技术,其发光原理是标记于抗原、抗体上的碱性磷酸酶催化底物(例如AMPPD)产生光子。



碱性磷酸酶(AP)催化AMPPD发光原理

碱性磷酸酶催化发光属于辉光(下面有详细解释)。
2、吖啶酯(AE)
上面我们讲了AP催化的化学发光属于辉光,而AE属于闪光。两者最重要的区别是对仪器的要求不一样,辉光由于持续时间长,底物加样和光子检测可以分开;而AE属于闪光,发光时间较短,需要在极短的时间内测定发光值,因此必须采用原位进样的方式,也就是底物加样和光子检测必须在同一位置。



AE闪光示意图



闪光、辉光不同的发光方式

3、辣根过氧化物酶(HRP)
HRP也属于间接化学发光,发光方式也是辉光。
反应原理如图所示:



HRP发光原理

4、电化学发光
电化学发光目前可以说仍然是罗氏专属方法学,虽然专利已经到期,国内有好几家IVD公司已经做出了电化学发光仪器及配套试剂,但市场占有率不高。
电化学发光中以二价的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+作为标记物,在一定的电压作用下,[Ru(bpy)3]2+释放电子成为[Ru(bpy)3]3+,同时电极表面的三丙胺(TPA)也释放电子成为阳离子自由基 TPA+,并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基TPA·;具有强氧化性的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+和具有强还原性的三丙胺自由基TPA·发生氧化还原反应,结果使[Ru(bpy)3]3+还原成激发态的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+*,然后它以荧光机制衰变释放出一个波长为620nm光子的能量,而成为基态的[Ru(bpy)3]2+。
文字描述,可能缺乏直观性,大家可以去B站看这个视频,非常清晰。电化学发光测定技术-罗氏电化学发光测定技术_哔哩哔哩_bilibili
5、均相(光激)化学发光
前面的几种化学发光方法都是基于磁微粒固相材料,需要对反应体系进行清洗,目前市场上出现了均相化学发光,以科美诊断为代表。
该技术起源于1994 年研究发现的单线态氧分子能量传递发光原理,并据此建立的光激化学发光技术(light initiated  chemiluminescent assay,LICA),光敏剂经激发光照射产生单线态氧,发光剂接受单线态氧能量传递产生荧光。
该技术采用供体微球和受体微球。两种微球表面包被有亲和涂层,常见的如抗体、亲和素等,可以结合待测生物分子,分子间相互作用会将供体和受体微球拉近至单线态氧扩散范围以内,即200 nm  以内,从而激发级联放大的化学发光反应。其发光原理为光激化学发光,供体微球表面涂布光敏剂苯二甲蓝,受体微球表面涂布发光剂二甲噻吩衍生物并螯合有稀土原子铕。因而,当用680 nm 的激光照射时,供体微球表面光敏剂分解环境中的氧形成单体氧分子( 氧自由基),单体氧分子扩散到受体微球,将能量最终传递给稀土原子铕,激发波长为615 nm、半衰期为0.3s的激发光,可以采用荧光扫描仪检测。
其发光原理如下图所示:




光激化学发光技术

目前我了解到的就是科美诊断、成都爱兴生物在使用这一技术,2022年的CACLP大家应该对科美的超大广告牌有一定印象。
但是对此技术我也有个疑问。从原理上来看,该方法学用于夹心法项目没什么问题,本来以为会很难应用在小分子、传染病抗体、自免、过敏等需要使用竞争法或者间接法的项目上。但是通过查询NMPA,发现北京科美也拿了一些竞争法项目的注册证。从NMPA网站上得到的信息我猜测他们的原理如下,由于没拿到相关说明书,只能猜测,如果有大佬,还请不吝赐教!


还有流式荧光法  胶体金  量子点免疫荧光   荧光定量 PCR    数字PCR等方法学将在后续的两篇文章中更新。

原文地址:https://zhuanlan.zhihu.com/p/641905157
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