总结一下IVD行业的检测平台（一）——ELISA、化学发光

Rose

作者：知乎
疫情结束后，IVD行业逐渐回到正轨，国内法规也在逐渐规范，总的来看，国内的IVD行业虽然内卷，但仍然向荣。
最近工作中交流中发现很多做IVD研发的小伙伴还不熟悉这个行业的一些技术平台及相应的原理，趁着最近时间充裕，在这里总结一下吧。由于能力有限，难以避免出现漏误，欢迎指出，共同进步。
一、ELISA(酶联免疫）

      1971年，Engvall等人将免疫组化的EIA（酶免疫分析）技术应用于靶蛋白检验，并发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，ELISA技术由此诞生。ELISA是酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的简称，目前已被广泛应用于生物学、医学科学等多种研究领域。
      ELISA法原理：利用抗原抗体的特异性反应，结合酶对底物的高效催化作用，来检测靶蛋白的含量。实验时，需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上，通过检测分子（酶或荧光基团），将化学信号转换为电信号，以OD值或发光值的结果，对靶蛋白进行定量分析。
根据方法学的不同，ELISA分为：双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法
原理如图所示：



ELISA方法学原理图

图中未展示捕获法原理图。捕获法原理与间接法较为类似，只是二抗更换为抗人IgM抗体。
如果想要了解更为详细的内容，油管视频可以看看。
https://youtu.be/ouHZep5ofW8
二、CLIA(化学发光法)

化学发光技术是结合了化学发光系统和免疫反应，通过化学反应产生光子，进而检测待测物的一种方法学。由于化学发光技术具有灵敏度高、精密度好、设备简单、操作方便、线性范围广、分析快、也便于实现自动化等优点，目前已广泛用于临床检测、食品安全、生命科学等领域。
化学发光技术总的来说是基于超顺磁性磁珠、发光底物、免疫学反应以及自动化仪器实现待测物质的检测。这里简单以一步法为例，做一个说明。这里的磁微粒的主要原料是四氧化三铁，具有超顺磁性，施加外磁场表现出磁性，撤除外磁场磁性消失。



一步法检测待测抗原原理

根据试剂测试待测物质时，需要清洗几次，分为了一步法、两步法、三步法等（这里不做详细解释，后续会出相关文章解释）。
根据不同的发光原理，大致可以分为以下类（这里对直接化学发光和间接化学发光不做区分，有兴趣了解的可以私信或评论）：
1、碱性磷酸酶平台(ALP)
该平台属于间接化学发光技术，其发光原理是标记于抗原、抗体上的碱性磷酸酶催化底物（例如AMPPD）产生光子。



碱性磷酸酶（AP)催化AMPPD发光原理

碱性磷酸酶催化发光属于辉光（下面有详细解释）。
2、吖啶酯（AE）
上面我们讲了AP催化的化学发光属于辉光，而AE属于闪光。两者最重要的区别是对仪器的要求不一样，辉光由于持续时间长，底物加样和光子检测可以分开；而AE属于闪光，发光时间较短,需要在极短的时间内测定发光值,因此必须采用原位进样的方式，也就是底物加样和光子检测必须在同一位置。



AE闪光示意图



闪光、辉光不同的发光方式

3、辣根过氧化物酶（HRP）
HRP也属于间接化学发光，发光方式也是辉光。
反应原理如图所示：



HRP发光原理

4、电化学发光
电化学发光目前可以说仍然是罗氏专属方法学，虽然专利已经到期，国内有好几家IVD公司已经做出了电化学发光仪器及配套试剂，但市场占有率不高。
电化学发光中以二价的三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+作为标记物，在一定的电压作用下，[Ru（bpy）3]2+释放电子成为[Ru（bpy）3]3+，同时电极表面的三丙胺（TPA）也释放电子成为阳离子自由基 TPA+，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基TPA·；具有强氧化性的三联吡啶钌[Ru（bpy）3]3+和具有强还原性的三丙胺自由基TPA·发生氧化还原反应，结果使[Ru（bpy）3]3+还原成激发态的三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+*，然后它以荧光机制衰变释放出一个波长为620nm光子的能量，而成为基态的[Ru（bpy）3]2+。
文字描述，可能缺乏直观性，大家可以去B站看这个视频，非常清晰。电化学发光测定技术-罗氏电化学发光测定技术_哔哩哔哩_bilibili
5、均相（光激）化学发光
前面的几种化学发光方法都是基于磁微粒固相材料，需要对反应体系进行清洗，目前市场上出现了均相化学发光，以科美诊断为代表。
该技术起源于1994 年研究发现的单线态氧分子能量传递发光原理，并据此建立的光激化学发光技术(light initiated  chemiluminescent assay,LICA)，光敏剂经激发光照射产生单线态氧，发光剂接受单线态氧能量传递产生荧光。
该技术采用供体微球和受体微球。两种微球表面包被有亲和涂层，常见的如抗体、亲和素等，可以结合待测生物分子，分子间相互作用会将供体和受体微球拉近至单线态氧扩散范围以内，即200 nm  以内，从而激发级联放大的化学发光反应。其发光原理为光激化学发光，供体微球表面涂布光敏剂苯二甲蓝，受体微球表面涂布发光剂二甲噻吩衍生物并螯合有稀土原子铕。因而，当用680 nm 的激光照射时，供体微球表面光敏剂分解环境中的氧，形成单体氧分子( 氧自由基)，单体氧分子扩散到受体微球，将能量最终传递给稀土原子铕，激发波长为615 nm、半衰期为0.3s的激发光，可以采用荧光扫描仪检测。
其发光原理如下图所示：




光激化学发光技术

目前我了解到的就是科美诊断、成都爱兴生物在使用这一技术，2022年的CACLP大家应该对科美的超大广告牌有一定印象。
但是对此技术我也有个疑问。从原理上来看，该方法学用于夹心法项目没什么问题，本来以为会很难应用在小分子、传染病抗体、自免、过敏等需要使用竞争法或者间接法的项目上。但是通过查询NMPA，发现北京科美也拿了一些竞争法项目的注册证。从NMPA网站上得到的信息我猜测他们的原理如下，由于没拿到相关说明书，只能猜测，如果有大佬，还请不吝赐教！


还有流式荧光法  胶体金  量子点免疫荧光   荧光定量 PCR    数字PCR等方法学将在后续的两篇文章中更新。

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