细胞凋亡检测操作流程2

流式小生

凋亡检测操作流程

二、 BrdU检测凋亡细胞DNA断裂片段

相关试剂及组分：

一步法: APO-DIRECT试剂盒（货号：556381）：

PartA（4°C保存）	PartB（-20°C保存）
PI/RNase A Solution	FITC-dUTP
Reaction Buffer	TdT Enzyme
Rinsing Buffer	Negative Control Cells：已固定细胞
Wash Buffer	Positive Control Cells：已固定细胞

二步法: APO-BRDU™试剂盒（货号：556405）：

PartA（4°C保存）	PartB（-20°C保存）
FITC-Labeled Anti-BrdU mAb	Br-dUTP
PI/Rnase staining buffer
Reaction Buffer	TdT Enzyme
Rinsing Buffer	Negative Control Cells：已固定细胞
Wash Buffer	Positive Control Cells：已固定细胞

  
实验操作（适用于APO-DIRECT试剂盒）：

1. 细胞固定：
    1) 用PBS洗细胞后，将细胞重悬于1%多聚甲醛的PBS溶液中，浓度为1-2x106/ml，冰浴30-60分钟。
    2) 300xg离心5分钟，弃上清。
    3) 用5ml PBS洗细胞两次，重悬于70%乙醇中，浓度为1-2x106/ml，冰浴30-60分钟。（70%乙醇
细胞悬液在-20°C放置12-18小时后进行细胞凋亡检测，得到的效果最好。细胞可以在-20°C保存几
个月。）

2. 配制染色液，现用现配。

DNA标记液	1个测试	5个测试	10个测试
Reaction Buffer	10.00μl	50.00μl	100.00μl
TdT Enzyme	0.75μl	3.75μl	7.50μl
FITC-dUTP	8.00μl	40.00μl	80.00μl
蒸馏水	32.2500μl	161.25μl	322.50μl
总体积	51μl	255μl	510.00μl

3. 细胞染色：
      1) 取离心管和Falcon试管，按标本顺序编号。
     2) 取1x106细胞悬液加入离心管中，300xg离心5分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。
         质控细胞（Negative Control Cells、Positive Control Cells）：混匀后取1ml（细胞数约 1x10^6/ml）加入离心管中，300xg离心5分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。
     3) 每管各加入1.0ml Wash Buffer，洗细胞两遍，弃上清。
     4) 加入DNA标记液50μl重悬细胞。
     5) 37°C温育60分钟（或者室温过夜），每15分钟摇匀一次。（非质控细胞37°C温育时间需根据不同 情况有所凋整。）
     6) 每管加入1.0ml Rinse Buffer，300xg离心5分钟，弃上清。重复两遍，弃去上清。
     7) 加入0.5ml PI/RNase A Solution，混匀。若细胞浓度低，可将用量调整到0.3ml。
     8) 室温避光孵育30分钟。
     9) 3小时内上流式细胞仪测定结果。



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