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凋亡检测操作流程
二、 BrdU检测凋亡细胞DNA断裂片段相关试剂及组分:
一步法: APO-DIRECT试剂盒(货号:556381):
PartA(4°C保存) | PartB(-20°C保存) | PI/RNase A Solution | FITC-dUTP | Reaction Buffer | TdT Enzyme | Rinsing Buffer | Negative Control Cells:已固定细胞 | Wash Buffer | Positive Control Cells:已固定细胞 |
二步法: APO-BRDU™试剂盒(货号:556405):
PartA(4°C保存) | PartB(-20°C保存) | FITC-Labeled Anti-BrdU mAb | Br-dUTP | PI/Rnase staining buffer | Reaction Buffer | TdT Enzyme | Rinsing Buffer | Negative Control Cells:已固定细胞 | Wash Buffer | Positive Control Cells:已固定细胞 |
实验操作(适用于APO-DIRECT试剂盒):
1. 细胞固定:
1) 用PBS洗细胞后,将细胞重悬于1%多聚甲醛的PBS溶液中,浓度为1-2x106/ml,冰浴30-60分钟。
2) 300xg离心5分钟,弃上清。
3) 用5ml PBS洗细胞两次,重悬于70%乙醇中,浓度为1-2x106/ml,冰浴30-60分钟。(70%乙醇
细胞悬液在-20°C放置12-18小时后进行细胞凋亡检测,得到的效果最好。细胞可以在-20°C保存几
个月。)
2. 配制染色液,现用现配。
DNA标记液 | 1个测试 | 5个测试 | 10个测试 | Reaction Buffer | 10.00μl | 50.00μl | 100.00μl | TdT Enzyme | 0.75μl | 3.75μl | 7.50μl | FITC-dUTP | 8.00μl | 40.00μl | 80.00μl | 蒸馏水 | 32.2500μl | 161.25μl | 322.50μl | 总体积 | 51μl | 255μl | 510.00μl |
3. 细胞染色:
1) 取离心管和Falcon试管,按标本顺序编号。
2) 取1x106细胞悬液加入离心管中,300xg离心5分钟,弃去乙醇,留下沉积细胞。
质控细胞(Negative Control Cells、Positive Control Cells):混匀后取1ml(细胞数约 1x10^6/ml)加入离心管中,300xg离心5分钟,弃去乙醇,留下沉积细胞。
3) 每管各加入1.0ml Wash Buffer,洗细胞两遍,弃上清。
4) 加入DNA标记液50μl重悬细胞。
5) 37°C温育60分钟(或者室温过夜),每15分钟摇匀一次。(非质控细胞37°C温育时间需根据不同 情况有所凋整。)
6) 每管加入1.0ml Rinse Buffer,300xg离心5分钟,弃上清。重复两遍,弃去上清。
7) 加入0.5ml PI/RNase A Solution,混匀。若细胞浓度低,可将用量调整到0.3ml。
8) 室温避光孵育30分钟。
9) 3小时内上流式细胞仪测定结果。
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