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[分享] 细胞凋亡检测操作流程2

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发表于 2015-12-30 08:57 | 显示全部楼层 |阅读模式

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凋亡检测操作流程

二、 BrdU检测凋亡细胞DNA断裂片段
相关试剂及组分:



一步法: APO-DIRECT试剂盒(货号:556381):
PartA(4°C保存)PartB(-20°C保存)
PI/RNase A SolutionFITC-dUTP
Reaction BufferTdT Enzyme
Rinsing BufferNegative Control Cells:已固定细胞
Wash BufferPositive Control Cells:已固定细胞

二步法: APO-BRDU™试剂盒(货号:556405):
PartA(4°C保存)PartB(-20°C保存)
FITC-Labeled Anti-BrdU mAbBr-dUTP
PI/Rnase staining buffer
Reaction BufferTdT Enzyme
Rinsing BufferNegative Control Cells:已固定细胞
Wash BufferPositive Control Cells:已固定细胞
  
实验操作(适用于APO-DIRECT试剂盒):

1. 细胞固定:
    1) 用PBS洗细胞后,将细胞重悬于1%多聚甲醛的PBS溶液中,浓度为1-2x106/ml,冰浴30-60分钟。
    2) 300xg离心5分钟,弃上清。
    3) 用5ml PBS洗细胞两次,重悬于70%乙醇中,浓度为1-2x106/ml,冰浴30-60分钟。(70%乙醇
细胞悬液在-20°C放置12-18小时后进行细胞凋亡检测,得到的效果最好。细胞可以在-20°C保存几
个月。)

2. 配制染色液,现用现配。

DNA标记液
1个测试
5个测试
10个测试
Reaction Buffer
10.00μl
50.00μl
100.00μl
TdT Enzyme
0.75μl
3.75μl
7.50μl
FITC-dUTP
8.00μl
40.00μl
80.00μl
蒸馏水
32.2500μl
161.25μl
322.50μl
总体积
51μl
255μl
510.00μl

3. 细胞染色:
      1) 取离心管和Falcon试管,按标本顺序编号。
     2) 取1x106细胞悬液加入离心管中,300xg离心5分钟,弃去乙醇,留下沉积细胞。
         质控细胞(Negative Control Cells、Positive Control Cells):混匀后取1ml(细胞数约 1x10^6/ml)加入离心管中,300xg离心5分钟,弃去乙醇,留下沉积细胞。
     3) 每管各加入1.0ml Wash Buffer,洗细胞两遍,弃上清。
     4) 加入DNA标记液50μl重悬细胞。
     5) 37°C温育60分钟(或者室温过夜),每15分钟摇匀一次。(非质控细胞37°C温育时间需根据不同 情况有所凋整。)
     6) 每管加入1.0ml Rinse Buffer,300xg离心5分钟,弃上清。重复两遍,弃去上清。
     7) 加入0.5ml PI/RNase A Solution,混匀。若细胞浓度低,可将用量调整到0.3ml。
     8) 室温避光孵育30分钟。
     9) 3小时内上流式细胞仪测定结果。



关于更多产品您可以通过以下方式联系我们:
免费热线: 4008-168-068          电话:021-38015269/89      
Email: info@univ-bio.com         网址: www.univ-bio.com
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