在病原NGS（mNGS）的应用中，将血液微生物游离DNA（mcfDNA）作为靶标已成行业主流。但当我们谈论cfDNA时，我们在谈论什么？它是从哪里来，又到哪里去？这是一个单纯的生物学问题，还是各家检测单位产品差异背后的“隐形推手”？基于2025年卢煜明教授关于cfDNA的重磅综述，结合病原NGS的实战经验，笔者希望通过本系列文章，带大家从“根”上重新认识我们的检测靶标。血液样本容易采集，相对无创，基于该样本类型中的cfDNA进行无创产前、肿瘤基因以及病原体检测明确诊断，已成为医疗诊断领域的重要靶标。虽然无创产前、肿瘤基因的检测靶标是来源于人体的cfDNA，而病原NGS的检测靶标是来源于入侵人体的微生物cfDNA（后文简称mcfDNA），两者在载量、长短、半衰期等方面存在诸多差异，但也在清除途径上存在相似之处。一、从哪里来：宿主cfDNA的七大来源凋亡 (Apoptosis): 当接收到来自于外部和内部的死亡信号后，细胞启动程序性死亡。在凋亡小体中释放的DNA片段长度在 166-1500 bp（其中 166 bp 即包裹核小体的DNA长度），随后通过吞噬细胞如巨噬细胞识别和清除。坏死 (Necrosis): 在热、机械、渗透压、刺激因子等生化压力下导至细胞的直接意外死亡，即非程序性、被动死亡。释放大于 10000 bp 及以上高分子量的大片段。坏死性凋亡 (Necroptosis): 具备坏死的形态特征，但属于程序性死亡。它在接受到死亡受体信号激活、DNA损伤等压力信号或凋亡途径被抑制时发生。同样释放大于 10000 bp 的大片段，并大量释放细胞内容物引起炎症反应。焦亡 (Pyroptosis): 由病原体及其分子引发的高度炎症性程序性死亡，是机体的天然免疫反应，主要存在于巨噬细胞和单核细胞中。释放大于 10000 bp 的大片段（但不呈现包裹单个核小体的梯度特征）和大量的促炎症因子。中性粒细胞胞外诱捕 (NETs): 中性粒细胞受到病原体激活后，细胞膜破裂，将细胞内的DNA和蛋白释放到胞外形成“网”，以捕杀病原体和限制感染扩散。释放的DNA为平均长度约 8600 bp 的大片段。细胞外囊泡主动释放 : 细胞通过分泌包含单链或双链DNA的细胞外囊泡，主动释放cfDNA以维持稳态或调节免疫。主要分为凋亡小体（1-5 μm）、微囊泡（100 nm-1 μm）和外泌体（<150 nm）。这类释放的DNA片段较长（可超 10000 bp），且能有效抵抗细胞内多种DNA酶的降解。成红血细胞和巨核细胞来源: 在红细胞生成过程中成红血细胞的去核化，或血小板生成及巨核细胞凋亡过程中，均会释放cfDNA。图1. cfDNA七大来源：凋亡、坏死、坏死性凋亡、焦亡、中性粒细胞胞外诱捕、细胞外囊泡主动释放、成红血细胞和巨核细胞凋亡来源 总体来讲，凋亡、坏死、坏死性凋亡、焦亡、NETs这五大类可归类为细胞死亡相关的被动性释放；而潜藏在细胞外囊泡中或经由细胞成熟过程释放则属于主动型释放。这七大来源构成了血液中99%以上的宿主核酸背景（即我们需要去除的“噪音”），而我们需要捕获的微生物信号，则有着其独特的释放机制。1.对于感染性疾病来说，部分细菌也会主动“出芽”，形成囊泡。这样DNA（包含耐药基因和毒力基因）可以通过外膜囊泡被运输到远处甚至宿主细胞中。而且这些外膜囊泡如同保护层，使其能够有效逃避血液中针对裸露DNA的核酸酶降解。2.mcfDNA的来源还包括特定形成生物膜的病原体（如铜绿假单胞菌）。研究表明，胞外DNA 是生物膜的重要结构成分，类似于“钢筋混凝土”中的钢筋，帮助细菌抵御免疫攻击。3.mcfDNA也可以来自于前文提到的NETs。这种机制生成的“网”中既包含了宿主DNA，也包含了它捕获的病原体及其cfDNA，二者与蛋白纠缠在一起，防止病原体进一步扩散。4.在脓毒症或抗感染治疗过程中，抗生素的使用是常见的，因此大量的微生物cfDNA也来源于病原体本身如细菌的裂解死亡这一被动途径。这种被动释放往往源于激烈的“战场厮杀”：病原体或因抗生素破坏了细胞壁而崩解，或遭到宿主免疫系统——特别是补体系统的攻击打孔而发生裂解。这不仅解释了mcfDNA的来源，也揭示了为什么相比于培养（只能长活菌），病原mNGS受抗生素的影响相对较小、阳性率更高——因为它的靶标可以是死掉的病原菌残留的“**”（核酸片段）。三、到哪里去：清除方向与片段差异那cfDNA是如何清除的呢？总体三大方向：通过 DNase I 等核酸酶的降解、网状内皮系统（肝脏库普弗细胞和脾脏巨噬细胞）摄取、或经由肾脏滤过进入尿液代谢。如果清除不及时，会引发持续炎症，参与脓毒症等疾病进程。因此，监测脓毒症患者的cfDNA清除效率可成为评估疾病严重程度和预后的重要指标。另外，肾脏滤过作为重要代谢途径，意味着尿液中存在的mcfDNA片段，或许可以成为泌尿系统感染的重要检测靶标。图2. 核酸酶介导的cfDNA清除和经肾脏过滤示意图（图中红色、绿色有缺口的圆形分别代表不同的DNA酶，浅蓝色和外部的深蓝色线缠绕共同组成了核小体）人源cfDNA： 像串珠一样，DNA缠绕在组蛋白上，呈现出 166 bp 及其倍数的规律性峰值。微生物mcfDNA： 由于缺乏组蛋白保护，裸露的细菌DNA更容易被血液中的酶随机切断，导至片段更碎、更短，文献报道在血浆环境中，其大多在 40-100 bp。其他参考： 无创产前（NIPT）利用的是胎儿游离DNA（cffDNA）显著短于母体（胎儿主峰约 143 bp vs 母体 166 bp）的原理；在尿液中，cffDNA甚至短至 29-45 bp。而在癌症和红斑狼疮患者中，cfDNA也呈现出显著的短片段特征（90-150 bp 或 <115 bp）。综上所述，微生物片段比胎儿片段更短，因此mNGS对短片段捕获技术的要求，比NIPT更高。其次，微生物cfDNA的超短片段特性（40-100 bp）以及极低的相对丰度，也决定了mNGS并非简单的测序，而是一场针对碎片化信号的捕获战。这也意味着mNGS检测不能照搬检测人类基因的常规策略，而需要针对超短片段进行专门的提取与技术优化，这才是决定检测灵敏度的核心。不过学习完这篇cfDNA的来与去的文章，笔者深感病原NGS领域mcfDNA还需要更多的科学探索，比如对不同微生物片段大小的探索，对不同病原引发的感染性疾病载量、半衰期的探索，甚至基于cfDNA预警患者预后产品的探索。前路很长，愿与有心人共进步~Malki, Y., Zhou, Q., Jiang, P., & Lo, Y. M. D. (2025). The comings and goings of cell-free DNA: Biological and clinical implications. Med, 100926.https://doi.org/10.1016/j.medj.2025.100926
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