共识更新|实体瘤常见驱动基因 DNA 和 RNA 高通量测序共检专家共识（2025 版）

高通量测序（high-throughput sequencing），又称下一代测序（next generation sequencing，NGS），近年来，随着NGS技术的快速发展，基于DNA和RNA的NGS技术在实体瘤驱动基因检测的临床应用日益广泛，并出现了多种DNA和RNA共同检测的技术路线。

图：高通量测序技术原理。下一代 (或第二代) 测序包括Illumina测序(A)和ThermoFisher的IonTorrent (B)。

为了规范临床实践、提高诊断准确性，中华医学会病理学分会和国家临床病理质控中心组织分子病理专家，阐述了DNA-NGS和RNA-NGS（DNA/RNA-NGS）共同检测在实体瘤常见驱动基因变异检测中的临床应用价值，比较了3种DNA/RNA-NGS共检策略的优缺点，并针对共检的样本选择与质控、文库构建技术方法、生物信息分析和报告规范等问题进行了深入探讨，并达成共识，旨在推动实体瘤DNA/RNA-NGS共检技术的临床规范化应用。

随着精准医学的发展，全面检测肿瘤驱动基因变异已成为肿瘤辅助诊断和靶向/免疫治疗的核心环节。NGS可以一次性提供肿瘤精准诊治所需要的数量众多、类型各异的驱动基因变异，已成为临床的普遍需求。目前已知的肿瘤驱动基因变异类型包括单核苷酸变异（single nucleotide variation，SNV）、插入缺失（insertion/deletion，Indel）、扩增（amplification，Amp）和融合（fusion）等。SNV/Indel为主要变异形式，针对SNV/Indel的靶向治疗已在临床中广泛应用并发挥重要作用。

图：HTS在真核生物中的应用。技术的进步使我们能够深入研究广泛的基因组信息范围，从单个核苷酸到整体基因组的结构。

在检测实践中，DNA-NGS检测对单核苷酸变异和小片段插入缺失具有高效性和准确性，但在融合变异检测方面存在一定局限性。RNA-NGS通过直接分析肿瘤细胞中的mRNA序列，避免了内含子的干扰，能够精准识别具有临床意义的融合转录本，从而大大提高基因融合变异检测的灵敏度。研究证实，RNA-NGS对NTRK、RET、ROS1等基因融合的检测下限可低至30个拷贝。此外，RNA-NGS能够额外检出10.0%15.3%的基因融合变异，ROS1融合检出率甚至可以提升50%，并减少DNA检测的假阳性结果，提升靶向人群的筛选效率。因此，DNA/RNA-NGS共同检测能够通过对DNA和RNA层面的变异进行全面分析，实现两者数据的互补，提高变异的检出率和准确性。

目前常见的DNA/RNA高通量测序共检策略包括以下3种：

1. 序贯共检（sequential approach）：对临床样本先进行DNA-NGS检测，对驱动基因突变阴性的患者使用留存样本或重新采集样本，补充RNA-NGS检测。

2. 平行共检（parallel approach）：对同一份样本的DNA和RNA进行抽提，随后分别对DNA和RNA样本进行平行建库、测序和数据分析，即DNA和RNA分管建库后各自测序分析。

3. 同步共检（unified approach）：对同一份样本的DNA和RNA进行抽提，在同一个体系和相同的操作步骤中对核酸进行建库、测序和数据分析，即DNA+RNA同管建库后测序分析。

图： DNA/RNA-NGS共同检测的3种策略对比示意图

目前，甲醛固定-石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）样本是分子病理检测最主要的样本类型。国内外研究证实了FFPE样本提取RNA进行融合基因检测结果与新鲜冷冻样本高度一致。然而，FFPE样本长期存储会引起核酸尤其是RNA的降解。因此，在临床应用中，建议尽量选择2年内的FFPE样本进行DNA/RNA-NGS共检，以确保检测的成功率和结果的准确性。穿刺细胞、胸腹腔积液细胞或其沉渣制作的FFPE样本也可应用于DNA/RNA-NGS共检。由于技术局限性等因素，对于液体活检样本目前暂不推荐采用。

样本收集时，需系统地记录采集和制备过程。标本采集方法和制备过程（如离体至固定时间间隔、固定方式、固定液浓度、pH值、固定时长和样本厚度等）均会影响后续提取DNA和RNA的质量。建议标本离体后尽快固定，采用3.7%中性缓冲甲醛液进行组织固定，并根据样本情况调节固定时长，通常手术样本为1248h，活检样本为624h。应尽量避免因组织脱水、固定不足或过度增加核酸降解的风险。样本制备时，应控制单片组织厚度在510μm，在不影响镜检的前提下尽可能保持较厚。肿瘤占比低于质控标准的样本需要富集肿瘤细胞，切片的保留时间不宜过长，以降低RNA暴露在空气中发生降解的概率，建议在切片后尽快提取核酸进行检测。

甲醛的固定和石蜡的高温渗入容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，因此核酸提取后需要进行质量控制。常用的质控指标包括核酸浓度、纯度、总量及完整度。

在进行肿瘤基因变异检测时，通常需要构建文库对特定的基因区域进行靶向富集。无论是基于DNA还是RNA的NGS，建库过程都需要为核苷酸提供适配子（adapters）以便于后续的测序反应。常见的靶向下一代测序检测建库方法包括扩增子法和杂交捕获法。

扩增子法建库是一种基于引物池实现特定基因区域扩增、得到文库的方法。由于在建库初期就锁定目标区域，扩增子法能高效富集目标片段，上靶率高，且非目标片段少。该方法能将有限的起始核酸量放大至足够检测的核酸量，适用于起始核酸量较小的情况，如肿瘤细胞稀少或RNA质量欠佳的FFPE样本。研究表明，扩增子法建库最低仅需10ng DNA和10ng RNA。扩增子建库的另外一个优点是步骤简单、周期较短。RNA反转录为cDNA后，扩增子文库构建过程接近于PCR反应，可短至45h，有利于提高分子检测报告的时效性。

杂交捕获法对目标区域的靶向富集是通过探针设计覆盖实现的，按照相应的参考基因组序列，采用定长的探针以一定的相互关系（如首尾相连式或叠瓦式）展开铺设，覆盖目标基因特定区域。该方法除考虑基因组同源性对上靶率的影响外，探针与探针之间几乎不会发生干扰，均一性好，相比扩增子法测序，其探针设计更加简便。然而，杂交捕获法操作复杂且多步骤间转化率差异较大，在文库构建过程中，目标片段难以在每一步充分保留，因而文库构建需要提供更多的起始样本投入量。捕获法建库中，DNA和RNA通常分别需要50200ng和501000ng，核酸投入量具体需参考检测试剂盒的要求。

序贯共检和平行共检，DNA和RNA的文库构建方法可分别或同时采用扩增子法和杂交捕获法，但由于DNA和RNA的文库构建分别在独立的体系中完成，互不干扰，技术难度相对较低。而同步共检是在同一个体系下对DNA和RNA同管建库，无论是扩增子法还是杂交捕获法建库，技术上均有一定挑战。同步共检建库之前首先需要将RNA逆转录生成cDNA，再和基因组DNA模板共同用于后续的反应。同步共检建库关键挑战在于如何在同一个反应体系里面通过引物或探针分别获取DNA和cDNA模板序列。目前国内外尚未见到基于捕获法的同步共检产品，扩增子法是同步共检技术的主要方法。

传统DNA-NGS的通用生物信息学分析流程大多适用于DNA/RNA-NGS共检的数据分析，包括数据清洗（如去除接头序列、低质量序列等）、参照基因组序列比对、去重、插入或缺失重比对、碱基与质量校正、变异识别、注释、过滤后输出等步骤。平行共检和序贯共检DNA和RNA的建库和测序独立进行，生信分析难度低。同步共检的数据分析，需特殊关注DNA与RNA来源的序列拆分，以用于各自相应的变异类型检测及质控。质量控制参数包括下机数据质控（如数据量、Q30等）、数据拆分清洗质控、数据比对及比对后处理质控、变异过滤和对照样本质控等多个方面，应根据检测产品和试剂盒说明书予以相应关注。DNA/RNA-NGS共检重要的生信指标意义和参考标准见表3。

DNA/RNA-NGS共检存在4种生信质控结果：

NGS的分子诊断报告应包括但不限于以下内容：

需要注意的是，分子病理实验室进行DNA/RNA-NGS共检，从样本接收到报告签发，需经过检测前、检测中、检测后全流程的质控，以保证检测的规范性和准确性，推荐的DNA/RNA-NGS共同检测流程如图2。

随着技术和流程的不断优化，DNA/RNA-NGS共检策略将更加普及，有助于发现更多驱动基因突变/融合，提供更精确和全面的分子诊断信息，以优化个性化治疗方案。