在分子生物学检测领域，准确、快速、高通量的检测方法一直是研究者们追求的目标。多重PCR探针熔解曲线分析技术（Multiplex PCR Probe Melting Curve Analysis，MPA 或MCA）作为一种创新的分子检测方法，将多重qPCR与熔解曲线识别结合于一体，能够在单一反应体系中实现多个目标序列的同步检测与精准识别。该技术兼具高特异性和可多重检测等优势，广泛应用于感染性疾病诊断、基因分型、食品安全与环境监测等领域，正逐步成为分子诊断的重要支撑工具。 01 技术原理 MPA技术基于荧光探针标记与热变性原理，通过设计多对引物与相应探针（如Taqman或分子信标探针），在一个qPCR反应中同时扩增多个目标，并通过探针杂交体的熔解行为，利用熔解曲线对产物进行区分和识别（图1），具体步骤包括： 不同探针与目标的杂交体具有不同的熔解温度（Tm），依据峰位和峰型可精确识别各目标，即使存在单碱基突变也能区分。 图1 Taqman和分子信标探针在多重qPCR多重熔解曲线中的使用1。A) TaqMan探针在低温水溶液中，未杂交探针因随机卷曲构象使荧光基团（F）与淬灭基团（Q）空间邻近而荧光微弱。与靶标杂交后探针呈现强荧光。当探针从靶标热解离（Δ）后，恢复弱荧光状态。B) 分子信标探针低温下未杂交探针因发夹结构导至淬灭效应而基本无荧光。与靶标杂交后呈现强荧光。靶标热解离后，未杂交探针形成类似TaqMan探针的随机卷曲构象，呈现弱荧光。熔解曲线分析（上图：荧光强度F随温度T变化）经导数转换（-dF/dT）后形成熔解峰图（下图）。 02 技术特点与优势 03 技术挑战 04 应用领域 05 产业化发展现状 1．国际市场 有多家多重分子检测产品已获得监管部门认证，例如： 2.中国市场 中国在多重PCR探针法熔解曲线技术方面也取得了重要进展，多家生物技术公司和科研院所正在开发相关产品，如博奥晶典、广州宝创、珠海宝锐、厦门智善等，涵盖感染性疾病诊断、肿瘤基因检测、遗传病筛查等多个领域。随着技术成熟度的提升和监管政策的完善，预计将有更多产品获得NMPA认证并投入临床应用。 06 结语 多重qPCR探针熔解曲线分析技术作为新一代分子检测方法，正凭借其特异性高、多靶点检测能力强、可实现单碱基区分等优势，在精准医疗、食品安全、环境监测等领域展现出强劲潜力。 尽管仍面临设计复杂、成本较高、标准化不足等挑战，但随着技术创新、平台集成化发展及监管体系完善，其未来发展前景广阔。通过持续优化与应用推广，该技术有望成为支撑分子诊断产业升级的关键力量。 为进一步推广多重PCR探针熔解曲线技术在临床诊断中的应用，Meridian特邀海南医学院张章博士举办线上技术讲座，欢迎点击下图中二维码预约收看！
参考文献： 1. Huang, Q., Liu, Z., Liao, Y., Chen, X., Zhang, Y., & Li, Q. (2011). Multiplex Fluorescence Melting Curve Analysis for Mutation Detection with Dual-Labeled, Self-Quenched Probes. PLoS ONE, 6(4), e19206. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0019206 2. Luo, T., Jiang, L., Sun, W., Fu, G., Mei, J., & Gao, Q. (2011). Multiplex Real-Time PCR Melting Curve Assay To Detect Drug-Resistant Mutations of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, 49(9), 3132–3138. https://doi.org/10.1128/jcm.02046-10 欢迎联系关注和咨询我们
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