在高通量测序（NGS）文库构建过程中，多重PCR（Multiplex PCR）法是一种常用的技术，可同时扩增多个目标序列，充分利用了PCR扩增的特异性和高效性，在引物设计的过程中已完成了对目标区域的锁定和富集，扩增出目标片段后，加上适配于测序平台的接头，形成最终的测序文库。 相比杂交捕获法，多重PCR法通过使用特异性引物对多个目标区域进行同时扩增，整个建库流程更加简化，节省了片段化、末端修复和加A尾等复杂步骤，显著提高了建库效率。尤其适用于目标区域明确、样本量较小的研究或临床应用。本文将详细介绍多重PCR法的原理、操作步骤以及关键注意事项。
01 多重PCR法建库原理及注意事项| 步骤 | 原理 | 注意事项 | | 第一轮扩增 | 利用多重PCR技术同时扩增多个目标片段，反应体系的各个成分及作用：
目标区域引物池：引导DNA聚合酶对特定靶点区域进行扩增。这是多重PCR中最关键的部分，决定了扩增的特异性和覆盖度。 多重扩增酶：是一种耐热DNA聚合酶，能够在多重PCR反应中高效扩增多个目标片段。与常规Taq酶相比，它往往更具灵敏度和特异性。 反应缓冲液：提供适宜的反应环境，比如合适的pH值和必要的盐离子（如Mg²⁺），以保证酶的最佳活性。还含有核苷酸（dNTPs），为DNA合成提供原料。 模板：待扩增DNA，反应体系的扩增效果取决于DNA模板的质量和浓度。 对照：通常是用于扩增反应的正对照和阴性对照。正对照用于验证反应体系是否正常运行，阴性对照确保没有非特异性扩增或污染。
| 多重扩增酶通常含有特殊的辅助成分或稳定剂，剧烈震荡可能会破坏这些成分的均一分布，影响酶的活性和扩增效果。此外，酶的蛋白质结构相对敏感,剧烈震荡还可能导至溶液中形成气泡，这会影响反应管内的液面高度，导至扩增效果不稳定。因此，操作时建议轻柔混匀。 多重PCR法中不同引物的Tm值可能有较大差异，要完全控制在2°C以内较为困难。因此，一种可行的解决方案是在PCR扩增程序中设置梯度退火温度，以兼顾不同Tm值的引物。比如，若引物的Tm值分布在58°C到65°C之间，可以设置退火温度的梯度从58°C逐渐递增2℃到65°C。梯度温度可以跨越不同的引物，使得每对引物在其最适合的温度下进行扩增。
| | 扩增产物纯化 | | | | 第二轮扩增 | 第二轮扩增引入测序接头，并进一步扩增目标区域。反应体系的各个成分及作用： 第一纯化后产物：含有目标区域的富集DNA片段，作为扩增模板。 接头 (adapters)：包含测序所需的序列（如Index和引物结合位点），使得扩增后的产物能够直接用于测序平台的测序。每个文库使用特定的接头，以区分不同样本的序列信息。 PCR反应混合物，通常包含高保真度的DNA聚合酶、dNTP（脱氧核苷三磷酸）和优化的缓冲体系。高保真DNA聚合酶能够确保扩增的准确性，减少扩增过程中引入的突变。与普通Taq聚合酶不同，高保真酶具有3'-5'外切酶活性，可以校正错误。
| | | 文库定量 | 使用Qubit dsDNA定量技术测定文库浓度，确保其符合测序需求。Qubit检测通过荧光标记与dsDNA结合，提供准确的文库浓度。 | |
02 相关基础知识
2.1 引物设计：多重PCR法建库中，引物设计是成功富集目标区域的关键。引物设计的好坏直接影响扩增效率、特异性以及实验结果的准确性。 （1）原理： 靶向性：多重PCR的目标是同时扩增多个DNA片段，因此引物设计需要高度靶向目标区域的保守序列，确保能够特异性结合基因组中的特定片段。 特异性：为了避免非特异性扩增，引物的设计必须兼顾引物之间的相互作用，如避免引物之间形成二聚体（Primer Dimer）或发夹结构（Hairpin）。这是保证扩增过程中不同引物不会互相干扰的基础。 均一性：设计多重引物时，每对引物的退火温度（Tm值）应尽量接近，以确保在同一个PCR反应中，各个引物都能在相同条件下有效扩增目标序列。此外，扩增片段的大小也应保持适度，通常在150-300bp之间，以获得均一的扩增效率。 引物浓度优化：引物在反应体系中的浓度分配需要合理调整，避免高浓度引物导至某些片段过度扩增，影响其他片段的扩增均一性。
（2）注意事项：
避免序列重复：引物设计中应尽量避免引物序列出现在基因组中的多个位置，防止非特异性扩增。可以通过生物信息学软件（如BLAST）检查引物的特异性。 引物间相互作用的避免：设计时需确保引物间不会发生互补配对，避免形成二聚体或发夹结构。常用软件如Primer3可以帮助检测潜在的二聚体和二级结构。 引物长度与Tm值：引物长度通常在18-25个碱基之间，Tm值应尽量保持在58-65℃左右，且各对引物的Tm值应尽量接近，以保证在相同的PCR反应条件下能同步扩增。 GC含量：引物的GC含量一般应保持在40%-60%之间，以确保引物的结合稳定性和扩增效率。过高或过低的GC含量会导至退火温度不稳定，从而影响扩增效果。 避免形成发夹结构：引物自身形成发夹结构（Hairpin）的可能性需要在设计时规避，否则会干扰引物与目标序列的结合，降低扩增效率。 引物浓度平衡：当一个反应体系中包含多对引物时，应根据扩增效果调整引物的浓度，通常可以通过实验优化找到每对引物的最佳浓度，避免出现某些引物过度扩增，其他引物扩增不足的情况。
（3）常用的引物设计软件工具： Primer3：广泛使用的引物设计工具，支持设计单引物或多引物，同时可以检测引物的二级结构、Tm值等参数。 Oligo Analyzer：此工具用于分析引物的二聚体和发夹结构，确保引物的稳定性和特异性。 BLAST：在设计引物后，可以通过BLAST数据库来验证引物的特异性，排除引物可能与非目标区域结合的可能性。
2.2 Illumina和MGI平台接头（adapter） （1）接头的基本功能无论是Illumina还是MGI平台，接头的核心功能相似，主要包括： 连接DNA片段：在DNA片段末端加上接头，使得DNA片段可以通过测序平台识别并进行扩增和测序。 引物结合位点：接头中包含用于测序和扩增的引物结合位点，确保测序反应的有效进行。 Index序列（索引序列）：接头中常常包含唯一的Index序列，便于在多样本混合测序中识别不同样本的来源。
（2）Illumina测序平台的接头Illumina平台的接头结构经过优化设计，主要用于桥式扩增（bridge amplification），并且与Illumina测序仪上的寡核苷酸探针相匹配。Illumina接头结构的关键组成部分包括： P5和P7接头：分别与测序芯片上的寡核苷酸探针结合，确保DNA片段能够被固定在测序芯片上，进行桥式扩增。 引物结合位点：接头中含有特定的序列，能与Illumina测序仪中的引物结合，启动测序反应。 双Index系统：通常包括两个Index序列（Index 1和Index 2），用于区分多样本文库。这在进行双Index测序时尤其重要，有助于提高数据准确性。
Illumina平台的接头功能特点：（3）MGI测序平台的接头MGI（华大智造）的DNBSEQ技术采用不同的文库构建和扩增机制，尤其是通过其独特的DNA纳米球（DNB）技术，在接头设计上也有所不同。 DNB构建机制：MGI平台上使用的文库接头不再需要与芯片表面的探针直接结合，而是通过接头帮助构建DNA纳米球。DNB是通过滚环扩增（RCA, Rolling Circle Amplification）生成的高拷贝DNA结构，不需要桥式扩增。接头的主要作用是帮助构建环状DNA模板，从而通过滚环扩增（RCA）生成DNA纳米球（DNB），这些纳米球被铺设到测序芯片上用于后续的测序反应。 引物结合位点：接头同样包含与测序引物相匹配的结合位点，这些引物会在测序时引导序列的扩增和读取。 单Index或双Index系统：MGI的接头设计中也包含样本识别的Index序列，通常可以根据实验需求选择使用单Index或双Index策略。
（4）两者的区别扩增机制：Illumina平台通过桥式扩增将DNA片段固定在芯片表面并进行扩增，而MGI平台则使用DNB技术，通过滚环扩增产生大量的DNA纳米球，并将其铺设在测序芯片上。MGI的这一技术避免了扩增偏差的积累。 接头的结合方式：Illumina的接头需要P5和P7接头与芯片探针结合进行扩增，而MGI的接头则主要用于构建DNB，并不需要与芯片探针直接结合。 数据质量：MGI的DNBSEQ技术因其扩增机制较少产生偏差，测序数据的均一性和准确性相对较高，特别是在GC含量偏高的区域，表现尤为突出。
作者简介：涓涓细流，一个想要为NGS检验工作人员做点事的人，希望以此提高大家的专业水平，减少检验质量事故发生的概率，为患者服务。纤纤不绝薄成林，涓涓不止江河生！
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