熔解曲线技术-基础篇

小编整理了关于熔解曲线技术的相关知识，想要了解清楚熔解曲线技术，除了技术的基本原理外，还要了解不同类型探针的作用原理、LATE PCR、减少非特异性扩增的方法，以及不同检测目的所使用的一些特殊方法，如异质性突变的富集、锁核苷酸的使用等。

本次主要介绍关于熔解曲线技术的基本原理和分类，不同类别的优缺点分析，以及目前该技术相关注册产品的汇总分析。其它内容小编后续会进行整理更新。

一、熔解曲线技术

采用荧光标记的探针或者核酸染料，在PCR反应完成后，通过逐渐增加温度并持续监测荧光信号强度来检测和分析扩增产物的方法。

当DNA双链结构解离一半时对应的温度即为该DNA片段的熔解温度（Tm），不同的DNA片段由于其碱基组成和长度的差异，具有不同的熔解温度（Tm），可通过Tm值对产物进行定性分析。

二、分类

1、染料法熔解曲线

核酸嵌入式染料（如SYBR Green I）会同双链DNA结合并发出荧光，不结合单链DNA，游离状态下不发出荧光。

 在熔解曲线分析阶段，随着温度的升高，双链DNA逐渐解离成单链，染料无荧光发出。

2、探针法熔解曲线

以双标记荧光探针为例，探针上标记荧光基团和淬灭基团，探针处于游离状态时，探针核酸链处于卷曲状态，荧光基团和淬灭基团靠近，无荧光发出；当探针结合到特异性位点时，探针被拉伸，荧光基团和淬灭基团远离，发出荧光。

在熔解曲线分析阶段，随着温度的升高，探针从特异性位点上解离下来，处于游离状态，无荧光发出。

3、多色探针熔解曲线法

通过对不同探针标记不同的荧光，探针与不同靶序列杂交后具有不同的Tm值，利用不同荧光和不同Tm值组合即可进行结果判断。

用途：突变检测、病原体检测

优点：单管多重，检测通量高、成本低廉，1条探针可检测多个靶标、操作简便、单管内完成检测，避免开盖污染

缺点：相较qPCR，灵敏度有所降低，多重检测，开发难度相对较大

4、高分辨率熔解曲线分析法（High Resolution Melting Curve Analysis,HRM）

该技术使用饱和染料，对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析。

饱和染料：LCGreen、EvaGreen、SYTO系列等，染料对PCR的抑制作用极小，因此可以过饱和使用，而像SYBR Green I这种不饱和染料，对PCR有较强的抑制作用，无法过饱和使用，就使得在熔解过程中解离下来的染料会重新结合到未结合染料的双链DNA上，造成检测结果不准确。

以点突变的检测为例，在几十bp的扩增产物中只有1个点突变，那么野生型和突变型的Tm值差异非常小，在普通的染料法熔曲分析中无法区分。通过HRM，使用适配的仪器，变温速率是0.02～0.1℃/s，每秒钟可以采集200个数据，对熔解曲线的形状进行分析，则可以对纯合/杂合/野生型进行区分。

用途：SNP、点突变、甲基化、异质性突变、未知突变的筛查、基因分型

优点：价格低廉、体系设计简单，不需要探针

缺点：无法满足多重检测的需要，对仪器的性能要求较高，孔间温度差异小、温度分辨率高、对模板的浓度和纯度要求较高、对G/C和A/T突变较难区分

三、熔解曲线法相关拿证产品汇总分析

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