综述：微流控在病原体快速检测的应用

2024-10-29 15:03| 编辑: 归去来兮| 查看: 112| 评论: 0|来源: 功能核酸

摘要: 传染性疾病依然是全球十大死亡原因之一，导至每年超过四百万人死亡。

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传染性疾病依然是全球十大死亡原因之一，导至每年超过四百万人死亡。活病原体检测在水质监测、食品工业、医疗检测等领域都具有重要意义，及时、灵敏且具有特异性的活病原体检测对于预防常见疾病的传播至关重要。

近年来，由于微流控技术能够小型化并显著简化实验过程，因此其在即时护理（POC）应用中的势头迅速增强。此外，微流控装置尤其是纸基微流控技术，已被证明在其用于资源有限的环境中的现场测试的应用中的关键优势。

在这篇综述中，研究团队对迄今为止已经开发的用于活病原体检测的微流控传感器进行总结，并讨论了它们与传统检测方法（细胞培养、代谢检测、PCR、ELISA等）在分析时间、检测限和目标微生物方面的比较。

首先对活病原体检测的常规技术进行了总结，包括细胞培养法以及非培养技术。细胞培养法具有高灵敏度和高特异性，但耗时长、成本高，无法有效检测VNCB（Viable but Non-Culturable Bacteria）；非培养技术主要通过评估细胞膜完整性、代谢活性或RNA检测等生物标志物来区分活细胞和死细胞。

接着将活病原体检测微流控系统分为微全分析系统（µTAS）与微流控纸基分析设备(µPADs)。µTAS通常使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）等材料制造，结合动力泵、注射器、加热器等进行样品和试剂的处理。µTAS设备的检测系统包括电极、荧光和比色法，而µPADs主要适用于资源有限的现场测试，它们结构简单、成本低，且易于制造。与常规方法类似，这些装置依赖于全细胞检测和细胞膜完整性，以及利用代谢生物标志物和细胞培养来评估细胞活力。

2012年开发了第一个使用嵌入染料的微流控设备，用于检测活的金黄色葡萄球菌（MRSA）细胞。设计PDMS和玻璃微流体芯片，其包括EMA预处理、细胞裂解、DNA变性和芯片上PCR（图1A）。紧接着对该芯片进行了进一步优化，使用金纳米颗粒进行快速光学检测以减少PCR步骤（图1B）。嵌入染料使用的最新进展已经通过将叠氮溴化丙锭（PMA）与等温扩增方法（例如LAMP和重组酶聚合酶扩增（RPA））耦合来实现，简化了工作流程并增加了其用于低资源设置和现场测试应用的潜力（图1C、D）。PMA/EMA样品处理传统上在试管中进行，涉及许多移液步骤、紫外线暴露和冷孵育期。该工作流程不仅需要有经验的操作人员，而且还将检测时间增加了1 h。为了将PMA处理集成到微流体装置中，研究人员提出通过使用3D打印芯片进行片上PMA处理，然后进行实时DNA扩增来检测活微生物细胞（图1E）。

图1 检测机制与微流体芯片示意图

近年来，一些微流控阻抗生物传感器已被开发用于检测活的全细菌细胞。该生物传感器由一个玻璃芯片与两个检测区制造使用微通道。检测区域由含有固定的抗沙门氏菌抗体的微间隙叉指电极（IDE）阵列制成，用于阻抗测量以检测细胞的存在/不存在（图2A）。

同样，另一种微流控阻抗生物传感器，其包含具有IDEA的三个通道，并且能够在1 h内检测三种沙门氏菌血清型，检测限为7 cell/mL（图2C）。以类似的方式,一种通过在玻璃基板上进行表面微机械加工而制造的芯片,集成了用于浓缩细菌细胞并将其引导至检测通道的各种电极阵列，其中在检测电极阵列上进行阻抗测量（图2B）。

图2 微流体芯片及其组件的示意图

基于代谢活性和细胞培养的活病原体微流控系统检测。ATP是细胞活力最常用的生物标志物之一，研究开发了一种用于实时检测气溶胶中ATP的生物传感器，首次将ATP测量纳入微流体装置，微流体通道用于将试剂与细菌细胞混合，使游离ATP与D-荧光素酶反应，并将混合物输送到检测区域，在检测区域中使用电路来测量生物发光强度（图3A），进而开发了3D µPAD来检测活细菌的ATP（图3B）。该过程涉及最少的试剂处理和快速检测，显示出POC应用的潜力。基于属特异性色谱反应，开发了一种2D µPAD装置，通过采用弯曲杆菌酶α葡萄糖苷酶特异性显色底物，选择性检测活弯曲杆菌微流体纸装置由两个聚氯乙烯（PVC）垫与滤纸中心压在一起组成，其中样品被引入并与干燥的基底接触（图3C）。

液滴微流控技术的最新进展使得液体细胞培养技术的小型化成为可能（图3D）。最近，一种由微毛细管阵列组成的“浸渍和测试”装置研发出来，其功能类似于液滴微流体，将样品分离到多个隔室中并计数活细菌（图3F）。

图3 基于代谢活性和细胞培养的活病原体微流控系统

点评：

1. 讨论了专门用于检测活病原体的微流控装置的发展，并总结了最近开发的新型微流控系统，与传统方法在分析时间、检测限和靶生物方面进行了对比。

2. 提供了对微流体技术用于活病原体检测的未来前景的见解，重点是快速和低成本的现场测试方法开发。

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