01 测序应用分类
表观基因组学专注于探究表观基因组，即生物体内所有遗传物质上的表观修饰。在这一领域内，DNA甲基化和组蛋白修饰是最为显著的两种表观遗传修饰方式，它们通过精细调控来影响基因的表达活性或引发突变。随着生物体的年龄增长，DNA甲基化模式发生变化，因此它被视为衡量生物学年龄和衰老过程的重要标志。此外，甲基化模式的异常与肿瘤的发生存在着直接的联系，为癌症研究提供了关键的线索。
02 基因组测序流程 DNA测序包括几个关键步骤：1）DNA提取；2）文库构建；3）上机测序；4）数据分析与解读。本次主要介绍核酸提取与文库构建实验环节。
1)DNA提取 总的来说，核酸提取包括裂解和分离纯化两个过程。 核酸是复杂的生物大分子，通常位于细胞核内，并与各种蛋白质结合在一起。为了获得高质量的核酸分子，需要将细胞进行裂解以释放核酸分子（裂解），并需要利用核酸与蛋白质等其他分子理化性质的差异，从混杂的溶液中将核酸分子分离出来（分离纯化）。 同时，为了便于后续的研究，需尽可能保证核酸分子一级结构的完整性，并避免蛋白质、脂类物质和多糖等生物大分子的污染。
自1868年瑞士医师米歇尔（Friedrich Miescher）首次成功从细胞中提取出核酸（DNA）以来，大量的研究人员不断在各种理化条件下对核酸提取过程进行优化和实验，核酸提取的方法也从经典的酚氯仿法、盐析法发展到当前广泛使用的硅胶膜离心柱法、磁珠法等。
更多相关文章： 2)文库构建 一般来说，制备用于NGS分析的DNA文库的核心步骤是：（i） 将目标序列片段化或将目标序列大小调整到所需长度，（ii） 将特定的测序接头连接到目标片段的两端，（iii）通过PCR扩增获取足够多能够上机测序的核酸分子（可选步骤）。
更多相关文章： 测序相关实验及原理 | 杂交捕获实验影响因素总结 03 转录组测序流程 RNA测序包括几个关键步骤：1）RNA提取；2）mRNA富集；3）文库构建；4）上机测序；5）数据分析与解读。本次主要介绍核酸提取与文库构建实验环节。
1）RNA提取 以Trizol法为例，其原理是： 核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA向疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有亲水性，因此向水层移动。 TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为DNA和蛋白质。
2)文库构建 一般来说，制备用于NGS分析的RNA文库（mRNA）的核心步骤是：（i）富集mRNA，（ii） 将目标序列片段化或将目标序列大小调整到所需长度，（iii） 由于提取的是RNA样本，还需要将RNA转化为双链 DNA，（iv） 将特定的测序接头连接到目标片段的两端，以及 （v） 通过PCR扩增获取足够多能够上机测序的核酸分子（可选步骤）。
其中有一点需要补充，mRNA富集之后通常有两种建库策略。 一种是mRNA富集之后结合oligo(dT) 进行反转录，得到与mRNA序列互补的cDNA长片段后，再反转成双链DNA（dsDNA），进而进行片段化（酶切法或超声法），得到片段化dsDNA之后的建库方法与DNA建库方法完全一致。 另一种是先将富集的mRNA打断（mRNA打断方法包括碱处理法、金属离子（Mg2+、Zn2+）溶液处理法、酶（RNaseIII）处理等），打断后立刻进行反转录，得到dsDNA之后的建库方法与DNA建库方法也完全一致。 更多相关文章： NGS丨一文读懂RNA建库 04甲基化测序流程 甲基化测序（表观基因组学）包括几个关键步骤：1）DNA提取；2）文库构建（甲基化建库）；3）上机测序；4）数据分析与解读。本次主要介绍核酸提取与文库构建实验环节。
流程基本与DNA测序流程类似，主要区别是建库过程。
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