体外诊断生物活性原料的研发与制备

体外诊断试剂原料分类体系

体外诊断试剂的原料可以分为两大类

一类是具有生物活性的可以特异性识别待测靶分子或催化其反应的生物大分子原料。

另外一类是不直接参与反应的各类有机和无机的小分子物质的非生物活性原料。

体外诊断试剂原料是指用于生化、免疫或分子诊断等试剂的反应体系原料，主要指核心反应体系。按照性质不同，体外诊断试剂原料可以分为：抗原和抗体、酶与辅酶以及其他原料。上游原料决定了体外诊断试剂检测水平质量的好坏，可以说这些关键原材料的选择和研制，影响体外诊断试剂各项性能水平（如灵敏度、稳定性）和应用价值，筛选到合适的原材料是研发的首要环节。也是体外诊断试剂成本构成最主要的部分。

那么生物活性原材料主要包括哪些呢？

第一类是抗原：包括蛋白质，多糖，多肽，脂，小分子化合物等，有天然抗原和人工抗原，从生物组织或细胞直接获得的为天然抗原，通过基因工程，化学合成等方法制备的抗原为人工抗原。

第二类是抗体，主要包括单克隆抗体和多克隆抗体。

第三类是酶，在体外诊断试剂原料中统称为工具酶。

其他原料

其他原料包括胶体金、酶底物系统、发光物质等信号体系，NC膜、酶标板、磁珠等反应体系载体，以及各种生物活性材料和精细化学原料等，起到帮助呈色、提供载体场所或提升原料性能等作用，以保障诊断反应稳定且顺利进行。

生物活性原料研发的基本原则

抗原的研发无论是天然抗原还是重组抗原，抗原是制备抗原类体外诊断试剂的原料，包括原核/真核重组抗原、天然抗原等，通过基因工程重组技术、蛋白纯化技术、细胞生物学技术以及化学合成技术等方法制备，适用于传染病诊断、食品安全诊断、消化道疾病诊断以及免疫系统疾病诊断等。都是通过纯化的方式获得，针对重组抗原更重要的抗原分子的设计，表达载体和宿主的选择。

抗体的研发包括多克隆抗体和单克隆抗体，通过免疫技术、杂交瘤细胞技术、细胞发酵技术等方法储备，用于心血管疾病诊断、肿瘤诊断、传染病诊断等。多克隆抗体主要通过免疫原和免疫动物，以及免疫剂量，免疫程序进行优化，单克隆抗体相对复杂还需要后期的杂交技术，细胞培养，细胞筛选，再次免疫来获得识别特异性表位的抗体。当然有很多抗体得到后可以进行测序，通过基因重组的方式来大规模获得。

酶和辅酶是制备荧光定量PCR及基因诊断等分子诊断试剂、免疫诊断试剂及生化诊断试剂的原料，包括逆转录酶、DNA聚合酶、碱性磷酸酶等，广泛适用于基因检测、肿瘤诊断、传染病诊断、凝血诊断、肝肾功能生化诊断等多种检测领域。酶的获得也是主要通过纯化的方式来进行。因此蛋白纯化技术和抗体制备技术作为两项关键的核心技术是生物活性原料开发的关键。会涉及到生物化学，分子生物学，免疫学，微生物学，基因工程，蛋白质工程，酶工程等多种学科。

生物活性原料的规模化制备

包括原材料准备，预处理，初纯和精纯。

原材料准备可以直接选择动植物的组织或细胞，或是通过基因工程手段得到的工程细胞和工程菌。

原材料预处理，通常而言可以采用高速匀浆，液氮研磨或超声等机械方式来破碎组织和细胞，也可以通过低渗，反复冻融，酶消化或表面活性剂处理等非机械方式，但要注意的是破碎的强度，太小释放不充分，太大又会导至生物活性原料变性。破碎后的原料会呈现浑浊，可以通过高速离心，滤膜过滤等方式去除或者采用饱和硫酸铵沉淀后去除。

初纯阶段主要通过沉淀和离心过滤的方法，常用的有硫酸铵沉淀法，优球蛋白沉淀法，等电点沉淀法等非变性沉淀法，或者利用有机溶剂，酸碱，热等变性沉淀法。

精纯主要依据分子大小，形状，表面电荷分布，亲疏水性以及特异性结合等性质进行的各种层析分离，主要包括离子交换层析，分子筛交换层析，亲和层析，疏水层析以及电泳等技术进行分离。

生物活性原料的保存

影响生物活性原料溶液状态保持的因素包括pH、离子强度、污染或残留的蛋白酶、保存的温度和反复冻融的次数。可以通过添加一系列的，缓冲体系，低温保存，表面活性剂，蛋白酶抑制剂，防腐剂，还原剂等来维持原材料的稳定。这里最常用的技术就是冻干技术。

生物活性原料的质量控制

质量控制最关键的是对每批纯化后的原料进行浓度，纯度鉴定，通过Elisa，蛋白定量，SDS-PAGE等方法进行，最终的体外诊断试剂的生物活性原料应该是高纯度，高活性且状态均一的成品，应保证外观，浓度，纯度，均一性和生物活性。

影响稳定性的原因

在体外诊断试剂所用的原料中，抗体、抗原、酶等蛋白质是最为重要的关键原料。其所具有的特异性结合、催化反应功能，对在预处理、贮存、使用加工等操作过程中存在的潜在有害影响非常敏感。保存在密封、干燥的环境将有助于确保长时间的稳定，但除非蛋白得到适当的保护，否则干燥过程有也可能使蛋白发生严重的变性。而保存在溶液状态，潜在的危害因素将会增多。

比如很简单的一个方面，pH值或者缓冲溶液的改变就能够使蛋白在溶液中的稳定性明显不同。使某种溶液状态稳定的方法并不一定就对另一种溶液有效。在生产过程中的其他因素也有可能影响产品的性能。这些因素包括原料来源、稀释和定时错误、温湿度不合适、曝光和容器材料等。

为了保证诊断检测的有效期和精确性，这些原料蛋白必须保持稳定和有效。因此，在诊断试剂中必须要添加适当的，适量的蛋白保护剂。

干燥状态稳定性

尽管大多数蛋白质在溶液状态的自然构象下发挥作用，但干燥或者冷冻状态仍然是稳定保存的首选。在这些相对稳定的状态下，诸如蛋白酶、氧化剂等有负作用的溶剂与蛋白质的频繁碰撞将会得到最大限度的减少。但是通过干燥或者其他相变方式，比如沉淀和冷冻，将溶剂从蛋白分子中去除，将可能损害蛋白质的功能构造。

这些相变可能使通常折叠在分子内部的疏水氨基酸暴露在分子表面，从而造成蛋白质分子通过疏水表面与其他分子结合，导至蛋白质分子的变性。干燥的方式包括自然风干或者冷冻干燥，例如试剂瓶中结合物的干燥、塑料板或者膜材料上包被抗体的干燥。

在要干燥的溶液中加入适当的溶质来防止蛋白质变性是一种非常有效的保持蛋白质稳定的方法。这些溶质的特点是都具有亲水基团，这些基团通过掩盖疏水性氨基酸从而达到稳定蛋白质功能构造的作用。因此，由于在干燥时溶剂的去除会促进蛋白与蛋白，尤其是蛋白与固相表面的相互作用，所以在干燥前加入保护剂非常重要。

无论是干燥方法还是保存条件，想要保持稳定都有很苛刻的要求。当蛋白应用到膜上时，通常要求非常快速的干燥或者冻干，以保持蛋白最佳性能和活力。而对于平板、试管或者微珠的蛋白包被来说，相对于快速干燥，确保组分的彻底干燥则更为重要。为了得到最大限度的有效期，所有干燥后的产品都需要保存在放有干燥剂的密闭容器中。

溶液状态稳定性

虽然抗体、抗原、酶以及其他诊断用蛋白在水溶液中处于天然的机能状态，但这并不是它们最稳定的状态。在溶液中，有众多的因素影响着蛋白的活性功能：

蛋白质分子变得更加柔韧易折，从而倾向于改变构象。

蛋白质分子和其他分子以及容器壁的碰撞频率增加了。

微生物污染的可能性增加了。

对温度升高和蛋白浓度降低造成的影响更加敏感。

蛋白质更易被氧化。

通常来说，溶解的蛋白质分子在较低的温度和较高的蛋白浓度下最为稳定。在刚好高于冰点的时候，蛋白质分子拥有较少的动能，而这些动能是蛋白质“摆脱”其能量最低的功能构造所必需的。

在溶液中，部分蛋白活性的损失是由容器壁的吸附、寡聚酶的解聚以及氧化剂、水解酶、微生物等痕量污染物对蛋白质的灭活等原因造成的，而在越高的蛋白浓度下（毫克每毫升范围或更高），损失的蛋白活性占蛋白总活性的比例也就越低。

影响稳定性的其他因素

蛋白来源、纯化方式以及化学偶联的方法都能影响蛋白试剂的活性和稳定性。例如，碱性磷酸酶的来源就对复合物的稳定性有重大影响；就溶液的稳定保存而言，将所需蛋白与对蛋白有伤害作用的酶（如水解酶、氧化酶）从原料中分离是非常重要的。若要保证溶液稳定，就必须去除或者灭活这些有害酶以及能产生这些酶的微生物。

在合成复合物时，大量的化学反应步骤已被证明能使酶和抗体分子之间形成共价键。其中的一些方法对某些酶-抗体复合物的稳定负面影响较低。如果一种酶联复合物丧失了酶联检测的活性但仍保持有酶活力，那么另外选择一种化学偶联方法也许能解决这个稳定性问题。

有时候，被认为是稳定性方面的问题实际上是由其他变数造成的蛋白量不足。也许就是一个很明显的稀释错误。生产商必须弃用那些有可能吸收蛋白或者抑制蛋白活性的容器材料，例如未处理的聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯或者玻璃。聚乙烯和聚丙烯是比较可取的容器材料。有色酶和其他含有氧化金属离子的蛋白溶液不能暴露在阳光下。

蛋白保护剂种类

影响蛋白活性的因素主要有溶液的PH值、盐分和糖分的浓度、微生物的作用及空气的氧化等。针对市场的需要，目前市面上有很多商品化的蛋白保护剂可供临床和科研生产厂家大批量使用，主要用于微孔板的封闭稳定、抗体稀释液、蛋白稀释液、酶稳定液等。选择这些商品化的试剂在研发初期会给部分企业解决很多问题并且节省研发时间。有些企业，出入成本的考虑，也会着手研发自己的蛋白保护液配方以降低成本以及获得更好的效果。目前蛋白保护剂主要包括：多羟基化合物、糖、氨基酸、聚合物、蛋白质等。

试剂原料产业链

图：体外诊断原料产业链