化学发光应用中羧基磁珠的质量评价方法

羧基磁珠是体外诊断试剂（如化学发光、电化学发光、磁免疫层析、细胞和生物分子分离）研发生产的重要原料。二十世纪八九十年代，Ugelstad等采用甲基丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸十八酯、苯乙烯、二乙烯基苯等不同单体合成表面形貌不同的聚合物微球，其中大孔微球通过活化溶胀法均匀吸附磁性纳米颗粒，表面再进行环氧修饰、羧基、氨基、硅羟基等修饰最终形成商品化的Dynabeads系列磁珠。该系列磁珠在细胞分离、核酸提取、免疫分析等方面得到了很好的应用。商品化程度高的生产免疫磁珠的公司除了始于挪威的Dynabeads，还有美国的Bangs beads、Cytiva和日本的JSR beads、FG beads、法国Merck等。国内对于免疫磁珠的使用严重依赖于进口，在磁珠国产化替代进程中，各生产厂家的生产工艺及表面修饰工艺不同，具有产品性能参差不齐，批间差大等问题。对羧基磁珠的相关理化性能如悬浮稳定性、磁响应性、粒径及粒径分布、表面Zeta电位、表面羧基密度等表征及控制将影响磁珠的性能及质量，进一步影响体外诊断试剂的性能和质量。本文将介绍羧基磁珠相关理化性能的基本检测原理及测试方法，以供磁珠生产企业或体外诊断试剂生产企业对磁珠原料性能评估时进行参考。

羧基磁珠的结构

羧基磁珠通常为磁性高分子复合微球，根据结构可以分为核壳类，以磁性纳米颗粒为核，高分子为壳；反核壳结构，以高分子微球为核，磁性纳米颗粒为壳；夹心结构，核和外层是高分子，中间层为磁性纳米材料；弥散型结构，磁性纳米粒子均匀分布在聚合物微球中。

图1：常见磁珠的分类

外观

磁珠的颜色通常由所组成的超顺磁性纳米颗粒的颜色决定，如四氧化三铁（Fe3O4）呈现黑色，g-三氧化二铁（g-Fe2O3）呈现红棕色。超顺磁的Fe3O4是铁的一种混合价态氧化物，由Fe2+和/或Fe3+构成，通常呈现棕黑色。其中Fe2+在室温或高温下会缓慢氧化成Fe3+，磁珠的颜色会逐渐由棕黑色变成红棕色。随着磁珠氧化程度的不同，所呈现的颜色会不同。对于外观质量的观测可在光线充足的条件下目测，必要时可采用标准灯源箱。可将固定浓度的羧基磁珠（固含量1%即10 mg/mL）经摇床充分分散后，进行观测，判断磁珠颜色是呈现黑色、棕黑色还是红棕色。必要时，可采用标准色卡进行颜色区分。磁珠颜色的变化对磁响应速度和超顺磁性的影响通常很小，关键要以磁响应速度作为判定标准。磁珠表面Fe3O4颗粒发生氧化后，会形成致密的氧化层，从而保护内部的Fe3O4不会继续被氧化。这薄层致密的氧化层对磁珠的磁响应速度和超顺磁性的影响非常有限。

固含量

磁珠的固含量是指在规定的实验条件下，磁珠样品经充分挥发水分而得到的剩余物质的质量分数。磁珠的固含量决定单位体积内磁珠的粒子数，从而会影响在试剂开发过程中可供链霉亲和素、特异性抗原或抗体包被的比表面积，进一步影响试剂的性能。磁珠的固含量测定采用烘干法。固含量测试时，平行取三个2 mL空离心管，在60 °C烘箱中烘烤1小时后取出，于室温冷却30 min，称量并记录空离心管称量值M空。平行取200 uL经充分分散的待测磁珠溶液加入至已干燥的2 mL离心管中称量并记录称量值M空+湿。随后将装有磁珠的离心管置于60 °C烘箱中烘烤18小时至恒重，取出后于室温中冷却30 min，称重并记录称量值M空+干。按公式（1）计算固含量。

固含量（%）=（M空+干-M空）/（M空+湿-M空）´100%…………………………………（1）

悬浮稳定性

在化学发光免疫诊断中，采用悬浮的磁珠作为载体，以独特的3D表面和较高的比表面积，为捕获目标分子提供了充分的接触面积和较高的灵敏度。但受到重力的影响，磁珠悬浮液在长期静置下可能出现分层的现象。磁珠的生产工艺、磁珠的聚集程度、磁珠的表面修饰、分散溶液的pH等均会影响其悬浮稳定性。可以通过将一定浓度（如10 mg/mL）的磁珠放置在2 mL离心管中，静置观察磁珠界面（磁珠在沉降过程中与水形成的分界面）下降一半的时间或者在固定时间内磁珠界面下降的高度，以进行不同批次及生产工艺磁珠的悬浮稳定性判断。

图2：磁珠悬浮稳定性测试示意图。以图片拍摄标尺为依准，测量磁珠在放置10分钟、30分钟、100分钟后磁珠界面下降的时间。（南京东纳生物羧基磁珠悬浮稳定性测试数据图）

磁响应性

磁珠在化学发光中及分子诊断、质谱样品前处理等其他生物医学检测领域的应用实现了可控磁分离，对加快检测速度及仪器的自动化具有重要作用。目前市面上的西班牙SepmagÒ生物磁性分离设备采用光学监测的方式，通过实时吸光度的测量判断磁珠的分离过程。但这种分离设备的价格昂贵，不适合一般磁珠生产企业或体外诊断试剂生产企业用于磁珠质检方法的建立。而磁力架可有效地进行磁珠分离，具有小巧轻盈、兼容2 mL或1.5 mL离心管、经久耐用、磁场强度高、分离过程快速高效等特点。可以采用2 mL圆底塑料离心管取经充分分散均匀的羧基磁珠溶液放置于表面磁场强度大于250 mT（2500 Gs）的磁力架上，进行侧向分离时间计时测定。

形貌与尺寸：扫描电子显微镜（SEM）

羧基磁珠的表面形貌及尺寸可以采用扫描电子显微镜（SEM）进行观测。SEM是一种采用细聚焦的电子束轰击样品表面，通过电子与样品相互作用产生的二次电子、背散射电子等对样品表面形貌进行分析的电子显微镜技术。SEM样品的制备通常非常简单，可取适量的磁珠溶液用去离子水稀释至一定浓度（例如0.1%），然后使用移液枪取样品滴加在硅片或锡箔纸表面，自然晾干。用SEM获取羧基磁珠样品的二次电子图像并采用静态图像分析方法，统计羧基磁珠（不少于100个微球），获得样品的平均尺寸和相对尺寸偏差。

图3：羧基磁珠SEM图（南京东纳生物羧基磁珠产品图）

水动力尺寸：动态光散射（DLS）

动态光散射法（Dynamic light scattering，DLS）是一种用来检测分散在溶液中亚微米级粒子大小的技术。该技术基于颗粒对光的散射，当光照射比波长小的粒子时，光会向周围所有方向散射。以单色且相位相干的激光为光源可观测到时间相关的散射强度的涨落，这种散射强度的涨落主要是由于粒子在溶液中做布朗运动所引起的相对位置随时间的变化。由实验过程中散射光强度的涨落及斯托克斯-爱因斯坦方程可推导得粒子的水动力直径。水动力直径与粒子的表面结构以及介质中离子的种类及浓度有关，通常会比电子显微镜测得的结果大。影响动态光散射粒径测量的因素包括介质的粒子浓度（影响双电层的厚度从而影响粒子的扩散速度）、温度（影响溶液的粘度）、表面结构（DLS计算的是球型粒子的水合直径，非球形粒子会改变平移扩散速度影响粒径大小）等。可取羧基磁性磁珠用水稀释至一定浓度（例如，0.02%），进行超声分散后进行DLS测量，获得羧基磁珠的平均粒径（ ）及多分散指数（PI）以评估磁珠的批间性能。

图4：动态光散射（DLS）的原理以及不同大小粒子悬浮液散射光的强度波动示意图

（图来源于A review of methods and techniques for characterization of structure, morphology and dispersion stability of microcapsules. Proceedings of University of Ruse-2019, volume 58, book 10.1.）

 表面Zeta电位

在悬浮液体系，纳米颗粒的表面是带电的。根据斯特恩双电层理论，纳米颗粒的带电表面将反离子吸引至表面附近。一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用而和表面紧密结合，构成双电层的紧密层（或称斯特恩层）。而其余离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层。颗粒运动时，会带着吸附层和部分溶剂分子一起移动，与液体之间形成滑动面，定义滑动面与液体内部的电位差为Zeta电位。Zeta电位的绝对值越高，悬浮颗粒间排斥力越强，悬浮液越稳定。反之，Zeta电位绝对值越低，颗粒间排斥力越弱，悬浮液越趋于凝聚。因此，Zeta电位可用于预测悬浮液的稳定性。

图5：双电层及胶体结构示意图（图来源于Recent Advances in Electric-Double-Layer Transistors for Bio-Chemical Sensing Applications，Sensors 2019, 19, 3425; Stability of colloidal systems – a review of the stability measurements methods, Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska Lublin-Polonia, Vol. LXXII,1, Sectio AA, 2017）

Zeta电位并不是纳米颗粒的固有属性，而是取决于颗粒表面与其液相分散介质之间的化学平衡。分散介质的化学成分和离子浓度的任何变化都会影响这种界面平衡，从而影响Zeta电位。因此，样品制备和测量过程如溶液体系的pH、浓度、离子强度、高价离子、样品池的污染、气泡的干扰以及介电常数、黏度、折射率、温度、电导率等测量参数的选择都会影响Zeta电位的测量。可取羧基磁珠用纯化水稀释至一定浓度（例如，0.02%），进行表面Zeta电位的测量（如采用电位粒度分析仪）以评估磁珠质量。

表面羧基密度

图6：羧基密度电导滴定曲线示意图（南京东纳生物羧基磁珠羧基密度滴定实验数据图）

电导滴定法是利用溶液体系电导率的变化确定滴定终点的一种滴定方法，适用于酸碱中和﹑氧化还原﹑沉淀反应等各种反应，滴定终点的判断直接关系方法的准确度。采用电导滴定法对磁珠表面羧基官能团的定量测定，对羧基磁珠下游应用中的表面偶联有较为重要的指导意义。取5 mL羧基磁珠（磁珠固含量1%），用纯水定容至40 mL。加入1 mL 0.05 mol/L 盐酸溶液，混合均匀。将电导仪探头插入羧基磁珠-盐酸分散体系中，用0.05 mol/L氢氧化钠溶液滴定磁珠-盐酸分散体系，记录每个滴定点对应的体系的电导率值。以电导值对消耗的NaOH溶液体积数制作曲线，根据曲线转折点计算羧基磁珠表面羧基含量。

NaOH首先与溶液中过量的盐酸反应，电导率由于H+浓度下降而迅速降低；当过量的盐酸被NaOH溶液完全中和时，溶液电导率降为最低，此时出现第一个转折点（a）；在磁珠表面羧基与NaOH溶液反应时，溶液电导率数值基本保持不变；当磁珠表面羧基与NaOH溶液完全反应后，溶液电导率随着NaOH溶液的加入而升高，此时出现第二个转折点（b）；两个转折点之间的电导率值基本保持不变，此阶段称为平台期。根据电导滴定法中平台期NaOH溶液的用量，判定羧基磁珠表面羧基含量。可按照公式（2）进行计算。需要注意的是该方法在测量低羧基密度磁珠时，可能会出现检测偏差。

C=（V2-V1）×C1/m……………………………………………………………（2）

式中：

C—羧基磁珠表面的羧基含量（mmol/g）；

V1—第1个转折点消耗氢氧化钠溶液的体积（mL）；

V2—第2个转折点消耗氢氧化钠溶液的体积（mL）；

C1—NaOH溶液的浓度（mol/L）；

m—羧基磁珠的用量（g）。

批间差

体外诊断试剂的质量很大程度上受其生产过程中所涉及到的人（人员）、机（机器）、料（原料）、法（方法）、环（环境）五个关键要素的影响。作为体外诊断试剂重点原料的磁珠的批间差将最终影响试剂开发的稳定性及批间差。在羧基磁珠工艺开发及认证时，对连续三批次生产羧基磁珠的各项性能指标（如上所述）进行测试并求得批间差。根据项目类别可设定批间差范围在5%-10%之间。对于稳定生产的羧基磁珠，对新生产批次磁珠的各项性能指标（如上所述）进行测试并以参照磁珠为标准计算相对偏差。根据项目类别可设定相对偏差范围在5%-10%之间。

稳定性

稳定性研究通常包括加速热稳定性研究（37 °C）、长期稳定性研究、效期外稳定性研究，也可根据实际应用体系增加酸碱稳定性研究、溶剂稳定性研究以及冻融稳定性研究。在稳定性研究各个条件及时间点，对三批次羧基磁珠的各项性能指标（如上所述）进行测试，并与对照样品进行比对，偏差设置一般可在5%-10%之间。

总结：

本文主要是介绍并推荐常规适用于一般磁珠生产企业或体外诊断试剂生产企业内部建立的羧基磁珠理化性能的质量控制方法。除此之外对于羧基磁珠的理化性能评价还包括透射电子显微镜（TEM）、红外光谱（FT-IR）、热重分析（TG）、X射线衍射分析（XRD）、振动样品磁强计（VSM）等，可根据实际情况进行增加补充。

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