导语 流式细胞术（FCM）——作为跨越一整个世纪，经过一代又一代科学家们不懈奋斗和努力下的结晶，现如今已经成为探索生物细胞奥秘的关键技术。FCM 是在细胞流动的状态下，快速检测细胞或颗粒物的荧光信号，从而判断细胞的属性及分化程度，实现细胞的定量分析和分选的技术。 由于 FCM 具有速度快、敏感性高、准确性好、采集数据量大、分析全面、方法灵活等优点，在免疫学、细胞生物学、生物化学等不同研究领域和临床诊疗中起着至关重要的作用。在这场历史长河中，诸多领域的科学家们共同见证了 FCM 从「无」到「有」的辉煌历程。 那么，FCM 在感染性疾病、健康管理、自身免疫性疾病、血液疾病、肿瘤疾病、原发性免疫缺陷疾病等 6 大领域中如何应用？让我们为大家一一揭开它的神秘面纱。 一、披荆斩棘的「前世」——第一台荧光细胞检测仪的诞生 1934 年，Moldaven 是世界上最早提出使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过 1 根毛细管的细胞数量，实现了从静止细胞到流动细胞的微观计数[1]。随后，流式细胞术在 1936 年至 1950 年间，经历了一段艰难的发展史（图 1）。 1953 年，Parker 和 Hutcheon 研究出一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形[2]。 1969 年，在 Van Dilla Fulwyler 及其同事们的不懈努力下， 第一台荧光检测细胞计数器问世。在科学家们的不断试验与改进下，开创了细胞免疫荧光染色和检测技术的新纪元。 1973 年，BD 公司与美国斯坦福大学合作，研制并生产了世界第一台商用流式细胞仪 FACS I。自此，FCM 进入飞速发展的新时代。
图 1 流式细胞术的发展史 二、蓬勃发展的「今生」——从人工手动到智能自动的华丽蜕变 自 20 世纪 80 年代以来，FCM 得到了迅速的发展。它从一个只有 Fulwyler, M. J. 等几名专家发展和使用的技术平台转变为一个通用的实验室工具和临床诊断系统。近 20 年来，FCM 逐步完成从人工手动到全自动化流水线的蜕变，成长为一项为患者不断谋求福祉的强大技术。 目前，FCM 已逐渐朝着标准化的方向发展，同一样本即使在不同实验室、不同操作人员、不同仪器上检测结果也能保持完全一致，大大地为患者节省了重复检测的时间和费用。 此外，为了提高整体疾病的诊疗水平，FCM 朝着方案互联的方向发展，不同仪器间的方案可以直接复制，让走在前沿的诊疗方案快速推广到各级医院，为加快区域医疗中心建设以及医联体 / 医共体的建立做出了巨大的贡献！ 三、立足当下，展望未来——FCM 在六大领域中的应用 （一）FCM 在感染性疾病中的应用 1. 利用 FCM 检测中性粒细胞表面的 CD64（nCD64）水平的意义 1）nCD64 可作为细菌感染的早期诊断指标：当机体受到感染时，nCD64 可在感染发生的 3～6 h 大量表达，发挥抗感染作用（图 2）。nCD64 在诊断细菌感染方面具有较高的敏感性和特异性，远优于 CRP 和 WBC 计数[3]。
图 2 FCM 检测 nCD64 的散点图和直方图 2）nCD64 指数有助于结核病的诊断和预后（图 3）：一项纳入 189 例活动性结核患者的研究显示，nCD64 指数诊断结核性脑膜炎（TBM）的敏感性和特异性分别为 53.85% 和 100%。且 nCD64 指数可随着患者病情的改善出现下降，并在治疗后 4 周显著下降[4]。
图 3 结核分枝杆菌感染患者 nCD64 的差异表达 2. FCM 检测单核细胞人类白细胞抗原-DR（mHLA-DR）有助于脓毒症的诊断及预后评估 与健康人群相比，脓毒症患者外周 mHLA-DR 显著降低，脓毒症第 3～4 日后患者 mHLA-DR 的快速恢复提示患者具有良好的临床预后。反之，mHLA-DR 持续降低往往与不良临床结局相关，如死亡、继发性感染等[5]。 3. FCM 在新冠感染中的应用 中国人民解放军总医院王福生院士团队发布在《柳叶刀呼吸医学》[6]上的全世界首例新冠病毒感染病理解剖报告中揭示，患者外周血 CD4+ 和 CD8+ T 细胞数量大幅减少，但其状态却表现为过度激活。 淋巴细胞减少是新冠感染患者的共同特征（图 4），并可能是与疾病严重程度和死亡率相关的重要因素。利用 FCM 进行外周血淋巴细胞亚群（TBNK）检测，在新冠感染早期及时动态监测患者免疫功能变化、判断病情发展，可以为疾病的转归和治疗提供指导作用。
图 4 长期新冠肺炎患者的病理特征变化[7] （二）FCM 在健康管理中的作用 华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科副主任汪峰教授曾指出：「免疫力检测联合常规检查能够更精准地发现亚健康状态，提示疾病风险」。TBNK 分析正是进行免疫力检测的重要手段，利用 FCM 进行 TBNK 计数分析，对机体的免疫状态进行精准评估，筛查免疫力低下的高风险人群，做到疾病的早发现、早诊断、早治疗。 新冠病毒可破坏人体免疫系统，导至淋巴细胞的直接损伤、分化障碍、诱导凋亡等。中华医学会健康管理学分会 2023 年《新型冠状病毒感染康复期人群健康体检特殊项目的专家共识》[8]提出：针对「阳康」后 3 个月内的人群，建议进行 TBNK 分析，从而评估机体免疫功能的恢复状况，发现异常状态后及时采取措施。 （三）FCM 在自身免疫性疾病中的应用 自身免疫性疾病的疾病活动主要与浆母细胞及短寿浆细胞分泌的抗体有关。应用 FCM 对患者外周血中浆细胞及细胞表面免疫标志进行分析，对疾病的诊断、预后判断和治疗监测都有一定的意义。 1. 外周血浆母细胞水平与系统性红斑狼疮（SLE）疾病活动度的变化呈现良好的相关性，是判断 SLE 疾病活动度、预测复发的敏感指标。 2. 预测、评估 B 细胞靶向药物疗效，预防疾病复发：应用利妥昔单抗治疗 6 个月后，检测浆母细胞水平 > 0.0008 × 109/L 的患者，在接下来的 26 周和 52 周内的复发率分别为 90% 和 100%（图 5）。因此，监测浆母细胞水平，可为疾病复发预警[9]。
图 5 在 6 个月时检测到血浆母细胞 > 0.0008 × 109/L，预示着更早的复发 （四）FCM 在血液疾病中的应用 FCM 通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和 DNA 的检测分析，在各种血液病的诊断、预后判断和治疗中具有举足轻重的地位。 1. 血液病免疫分型：2017 年《流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识》[10]指出，利用 FCM 对淋巴瘤进行免疫表型分析，可以实现白血病的诊断和治疗。其中，有些淋巴瘤可以用 FCM 明确诊断，主要包括急 / 慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、浆细胞肿瘤、T 大颗粒淋巴细胞白血病等。 2. 微小残留病变（MRD）监测：用多参数流式细胞术（MP-FCM）进行恶性血液病 MRD 监测，具有敏感性高、特异性好、适用范围广等优势（图 6）。2017 年《多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微小残留病中国专家共识》表示，目前已成为恶性血液病临床疗效观察和预后分层的重要依据[11]。 3. FCM 对其他种类血液病的诊断和治疗监测：如阵发性睡眠性血红蛋白尿。FCM 采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞 CD59 的表达做定量分析，辅助临床做出诊断并判断疾病的严重程度。
图 6 1 例急性白血病患者获得完全缓解后的 MRD 检测设门策略 （五）FCM 在肿瘤诊断中的应用 TBNK 分析在调节免疫和特异性杀伤肿瘤细胞方面起着至关重要的作用。利用 FCM 进行 TBNK 分析，可精准评估肿瘤患者的免疫状态，有助于早期诊断恶性肿瘤，进而为患者后续的治疗提供指导和依据[12]，主要包括： 1. TBNK 监测可反映肿瘤患者免疫状态：有研究显示，非小细胞肺癌患者的淋巴细胞增殖能力明显受损，各亚群细胞数量绝对减少，且 CD4+ T 淋巴细胞减少的患者总生存期低于 CD4+ T 淋巴细胞计数 > 500/uL 的患者（图 7）[13,14]。
图 7 研究队列中 CD4+ T 和 CD8+ T 淋巴细胞减少与总生存率之间的关联 2. T 细胞精细分型可在早期预测肿瘤发生：研究表明，CD4+ T 细胞计数和 CD8+ HLA-DR/CD8+ 和 CD8+ CD38+/CD8+ T 细胞百分比与肿瘤分期、淋巴结转移、远处转移呈正相关，是预测肿瘤进展的潜在生物标志物（图 8）[15]。
图 8 淋巴细胞亚群水平在各种肿瘤疾病中的预测价值 （六）FCM 在原发性免疫缺陷病中的应用 原发性免疫缺陷病（PID）是遗传因素或先天性免疫系统发育不良造成免疫功能障碍而引起的疾病，多在儿童阶段发病。通过 FCM 开展免疫功能评估，在重点人群中早期发现和治疗 PID 患者，可显著提高患者的存活率，减少致残率和临床不良事件，提高患者生命质量。 1. 用 FCM 检测 PID 相关蛋白及功能：某些 PID 可通过 FCM 检测特定蛋白及其功能，快速筛选或确诊，如 X 连锁无丙种球蛋白血症（XLA）、X 连锁高 IgM 综合征（XHIM）等[16]。 2. 对新生儿重症联合免疫缺陷病（SCID）进行筛查：目前已发现的 10 余种 SCID 致病基因共同特征为功能性 T 细胞完全缺如或显著减少。因此，定量分析 T 细胞受体剪切环（TREC）进行初筛后，阳性和可疑患者可利用 FCM 进行淋巴细胞亚群数量检测，以便进一步确诊和排除疑似病例。 3. FCM 评估接种疫苗前儿童的免疫功能：由于免疫系统缺陷，PID 患者接种部分减毒活疫苗后无法激活免疫防护，反而导至严重不良反应甚至死亡[17]。在免疫接种过程中，利用 FCM 对接种儿童的免疫功能进行判断和评估，可有效避免接种不适疫苗造成的感染和死亡。 小结 经过一个多世纪的发展之路，集多个学科的知识与智慧于一身的 FCM，具有快速、灵敏及能同时进行多参数分析等优点，已逐渐成为现代医学中必不可少的监测技术手段。FCM 的应用涵盖基础研究到临床实践中的各个方面，可对不同学科的建设与发展起到重要作用。同时，可参与感染、健康管理、风湿、血液、肿瘤、儿科等多个学科的疾病诊断、微小残留病变监测和预后评估，为临床诊疗提供极大的帮助和便利。 本内容仅供医疗专业人士阅读 内容策划：马腾 |
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