呼吸道病原体检测， NGS 技术大显身手！

一、mNGS用于呼吸道病原体检测

mNGS理论上能够对检测样本中的所有生物基因组进行无偏倚测序，在下呼吸道感染中应用广泛，包括感染病原体的诊断、预测病原体耐药性等。

1. 基于二代测序的mNGS

二代测序是一种高通量、短读长的分子测序方法，大多数二代测序方法在DNA合成同时进行测序，通过在DNA复制过程中捕捉具有特殊标记的核苷酸进行基因组测序获得序列，在获得短序列后通过生物信息学处理再进行数据分析得出结果。

基于二代测序的mNGS相较于常规病原学检测方法能显著提高呼吸道病原体检出率，已有不少研究肯定了其在呼吸道病原体检测中的积极作用，但与常规方法相比，其检测能力的优劣也可能因病原体种类不同而存在差异。

Qian等研究发现基于二代测序的mNGS在呼吸道样本中检测细菌和真菌的灵敏度高于传统培养（95% vs 54%），但检测病毒的灵敏度低于PCR。一项多中心回顾性研究对疑似肺部感染患者支气管肺泡灌洗液（BALF）进行病原体检测，发现基于二代测序的mNGS的检测阳性率和灵敏度明显高于常规检测方法（分别为47.97% vs 23.17%，53.49% vs 23.26%），尤其对结核分枝杆菌、非典型病原体、病毒、真菌而言，且特异性也优于常规检测（90.32% vs 77.42%，P=0.167）。

对于肺组织活检标本，用于mNGS检测的二代Illumina平台和三代纳米孔测序在真菌检测方面优于培养、qPCR、病理等微生物检测方法，然而在结核分枝杆菌检测方面两者均较弱。

此外，有研究发现对于感染性疾病（包括下呼吸道感染）基于二代测序的mNGS对病原体的识别相比于传统病原微生物培养受抗生素使用的影响更小。

2. 基于三代纳米孔测序的mNGS

纳米孔测序属于三代测序技术，测序原理依靠单链DNA或RNA序列不同碱基通过测序装置纳米孔时，引起电流变化并进行传感信号分析，进而实现单分子测序。

Mu等收集了292例可疑下呼吸道感染患者的171份BALF标本和121份痰标本，进行基于纳米孔测序的快速宏基因组测序检测和常规微生物检测诊断常见下呼吸道感染细菌病原体临床价值的比较，结果提示快速宏基因组检测和传统培养的流程所需时间分别为（6.4±1.4）h和（94.8±34.9）h，相较于培养和qPCR的验证试验，宏基因组检测的灵敏度为96.6%，特异度为88.0%，并在161份培养阴性样本中鉴定出63份病原体，显示其在病原体检出时间和检出率方面的优势。

基于纳米孔测序的mNGS在呼吸机相关肺炎病原体检测中也能更好识别合并感染，可在5h内检出病原体，并能较好预测病原体耐药表型。

此外，Yu等对164例疑似肺结核患者进行回顾性分析，采用痰液和BALF标本，将抗酸染色涂片、结核分枝杆菌培养、Xpert-结核分枝杆菌/利福平耐药检测（Xpert MTB/RIF）和对标本进行结核分枝杆菌全基因组测序的宏基因组纳米孔测序诊断肺结核的性能进行比较，结果显示四种方法的灵敏度分别为27.6%、57.8%、62.9%、94.8%，特异度分别为87.5%、100.0%、97.9%、97.9%，阳性预测值分别为84.2%、100.0%、98.7%、99.1%，阴性预测值分别为33.3%、49.5%、52.2%、88.7%，显示出纳米孔测序在肺结核诊断中的优异性能。

3. 基于二代测序和纳米孔测序的mNGS在呼吸道病原体检测中的比较

有研究对基于二代测序Illumina平台和基于纳米孔的宏基因组测序对疑似社区获得性肺炎（CAP）患者BALF病原体检测临床价值进行比较，收集66例患者的BALF标本进行传统培养和基于两种平台的宏基因组测序，结果提示基于纳米孔的宏基因组测序检出更多的病毒、真菌和分枝杆菌种类，两者在对除结核分枝杆菌复合群/非结核分枝杆菌外的细菌的检测能力相似，在主要病原体诊断性能方面，Illumina平台对细菌和鹦鹉热衣原体更具优势，纳米孔测序则对真菌更具优势，在指导药物治疗方面两种平台无显著差异，纳米孔测序流程所需时间显著短于Illumina平台。

纳米孔测序因其检测时间更短且成本更低比Illumina平台mNGS在呼吸道感染早期诊断中更具优势，也因此在危重感染患者早期诊断中具有广阔应用前景。

4. mNGS联合其他检查方法对诊断能力的提升

mNGS与常规检测方法联用能有效提高病原体识别率，与其他实验室检查化验结果相结合能提高疾病诊断能力。

我国一项纳入275例患者的多中心研究表明联合多种病原学检测方法可提高重症CAP患者病原体识别率，对血液标本、尿液标本和呼吸道标本在传统培养、血清学试验和PCR的基础上增加mNGS检测后病原体识别率提高了33.4%（40.8% vs 74.2%）。

Pan等对102例免疫功能正常疑似肺部感染患者BALF进行病原体检测发现，将BALF的mNGS结果和BALF中性粒细胞百分比或BALF中性粒细胞与淋巴细胞比值综合考虑能更有效区分感染和非感染患者。

5. mNGS应用于严重肺部感染患者

一项系统评价和荟萃分析显示mNGS对BALF病原体诊断能力在严重肺部感染患者或免疫功能低下肺部感染患者中比非严重肺部感染患者更好。另一项系统评价和荟萃分析表明根据mNGS结果调整治疗可降低重症肺炎患者28 d和90 d死亡率，缩短住院时间。体现出mNGS对严重肺部感染患者病原体诊断和改善预后的实用价值，一定程度提示早期应用mNGS的重要性。

6. 应用mNGS预测病原体耐药性

传统药敏试验需在培养出微生物后进行，而通过mNGS获得病原体耐药基因，以预测耐药表型可在更短时间得到耐药信息，但仍具有一定局限性。

Serpa等对mNGS预测危重下呼吸道感染患者病原菌抗微生物药物耐药性的研究发现与药敏试验相比，呼吸道病原菌mNGS预测耐药性的效果与病原菌、抗菌药物、核酸测序类型相关，对于革兰阳性菌，RNA联合DNAmNGS的灵敏度为70%，特异度为95%，对革兰阴性菌的灵敏度为100%，特异度为64%。

由于病原体可产生新的耐药基因突变，且存在突变基因是否表达等问题，因此通过mNGS预测病原体耐药性存在假阴性或假阳性的可能，还需进一步与药敏试验结果相结合。

二、tNGS用于呼吸道病原体检测

tNGS是结合基因扩增和高通量测序的一种针对目的基因序列进行测序的方法，与mNGS相比能富集特定病原体靶基因，增加检测灵敏度，且简化了生物信息学分析，但会漏检非靶向基因序列，不具备mNGS检测非预见病原体的能力，且在文库制备上需要更多的时间和试剂。

1. 靶向纳米孔测序

Zhang等对146例疑似下呼吸道感染患者相关标本进行研究表明靶向纳米孔测序鉴定病原体的灵敏度高于传统培养（91.1% vs 25.3%），且检出更多细菌感染和混合感染，可在16～17 h得到结果，并可用于测定耐药基因，是早期快速识别下呼吸道感染病原体的有效手段。Liu等对疑似肺结核患者BALF和痰标本进行分枝杆菌生长指示管法培养、XpertMTB/RIF方法和通过靶向扩增IS6110、rpoB、hsp65和gyrB四个序列应用纳米孔测序来鉴定结核分枝杆菌，结果显示三种检测方法诊断肺结核的灵敏度分别为48.28%、41.38%和75.86%，特异度分别为65.38%、100%和80.77%。

2. mNGS和tNGS应用于呼吸道病原体检测的对比

Gaston等比较了基于Illumina平台tNGS和mNGS对BALF病原微生物检测的能力，发现相较于复合临床标准，tNGS和mNGS检测能力相似，总体准确率为65.6%和67.1%，阳性一致率为45.9%和56.6%，阴性一致率为85.7%和77.2%。Li等对102例成年肺炎住院患者标本（包括血液、合格痰液、BALF、胸腔积液和淋巴结组织）进行tNGS和mNGS检测结果比较，该研究中tNGS检测只针对了153种病原体，mNGS仅进行了DNA检测，结果发现两种方法总微生物检出率无显著差异（82.17% vs 86.51%），mNGS检测出20种tNGS未检测出的微生物，tNGS检测出mNGS未检测出的鼻病毒A/B/C（单股正链RNA病毒），表明tNGS病原体检测范围虽没有mNGS广，但对呼吸道病原体的检测是有效的，并能同时检测DNA和RNA病原体。这些研究显示tNGS具有与mNGS相似的出色检测能力。由于tNGS具有更加便宜的价格，其在实际应用中也可能更易被患者接受。

三、其他呼吸道病原体检测方法

目前多种病原体检测方法处于研究或早期应用阶段，包括基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的检测方法以及基于CRISPR/Cas系统的检测方法等。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在临床微生物学中应用广泛，可对微生物的肽/蛋白进行分类鉴定，通常用于鉴定革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和真菌等。CRISPR/Cas是一种原核生物的自我防御系统，因其对DNA和RNA序列具有高度特异性，已被应用于核酸检测，与等温核酸扩增和试纸显色相结合能快速、特异检测病原体。

拉曼光谱无需复杂的样品制备步骤和复杂的设备，依赖于光的非弹性散射来探测样品中的分子振动，能够识别样品中的分子、生物和非生物成分。表面增强拉曼散射和机器学习相结合，可快速准确检测唾液中的呼吸道病毒，对病毒毒株种类及变异株进行鉴别分类，并对病毒浓度进行定量。拉曼光谱也能用于鉴别致病性肠杆菌科细菌，还可用于检测病原菌的耐药性，在呼吸道病原学诊断方面表现出一定潜力。基于深度学习区分荧光标记的不同病毒完整颗粒的显微镜图像以识别病毒的方法不需裂解、纯化和扩增步骤，可在5min内完成标记、成像和病毒鉴定，能够区分SARS-CoV-2、阴性样本、变异株以及其他常见呼吸道病原体，并可通过软件更新纳入更多病原体，为传统和基于测序的病毒诊断方法提供一种可能的替代。

此外，致病菌可产生多种挥发性有机化合物（VOC），其中一些可能作为微生物鉴定的生物标志物，通过呼出气体分析可用于无创细菌感染诊断，监测动态变化的VOC浓度曲线可能表明新发肺炎，并在研究中发现肺炎克雷伯耐药菌株和敏感菌株释放的一些VOC的含量不同，表明VOC可能作为细菌耐药标志物。

四、总结

呼吸道病原体的早期正确诊断对患者目标治疗以及预后至关重要，目前除常规检测方法外，NGS已成为临床病原学诊断的强有力手段，尤其在病原学诊断困难患者及危重症患者中更具优势。在解读mNGS结果时还需注意结合患者临床表现、实验室及影像学检查结果、传统病原学检查结果等综合考虑。此外还有多种类型的检测方法被逐步改进或开发用于呼吸道病原体的鉴定，但多数还需通过临床实践以明确检测性能。除上述检测方法之外，期待未来研发更多高效的检测平台为呼吸道病原诊断提供有效帮助。

参考文献略

作者：马鹏程，陈愉

单位：中国医科大学附属盛京医院呼吸与危重症医学科