一种开发多重PCR的突破性工具！ Smart-Plexer

作者开发了Smart-Plexer，这是一种使用单路PCR反应为基础来生成最优多重检测的框架。在定义靶标数量并上传实时PCR单路检测数据集后，Smart-Plexer将结合来自每个靶标的扩增曲线数据，模拟多重检测(如下图)。将Smart-Plexer与扩增曲线分析(ACA)方法进行了耦合和评估，通过扩增曲线中的动力学信息，ACA可以有效识别反应中的不同靶标。

Smart-Plexer通过距离测量(如欧几里得距离)来分析每个靶标的s型曲线之间的差异。使用平均距离评分(ADS)和最小距离评分(MDS)排序多重检测。选择评分高的多重检测进行实验测试，并使用ACA方法评估每个多重检测在靶标识别方面的分类性能。高评分和低评分多路复用之间靶标间距离的差异，导至不同的ACA分类精度。

为了评估Smart-Plexer在芯片多重开发和ACA分类准确性方面的性能，作者设计了三个引物集，分别针对腺病毒(hav)、人类冠状病毒HKU1 (HCoV-HKU1)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)。用合成DNA对引物进行评估，并用实时数字PCR (qdPCR)进行检测。

对每个引物组进行湿实验室测试，并将原始数据合并为27个模拟多重检测。一组扩增曲线，可以被认为是多维空间中的数据点。所有曲线中位数之间的距离被用来生成所有可能组合的平均距离评分（ADS）和最小距离评分（MDS）。下图直观地表示了ADS和MDS的计算机模拟测试和湿实验室测试之间的相关性。在ADS和MDS中，归一化曲线相关性得分高于其他曲线。这些结果强调了作者的评分系统(基于ADS和MDS)的可用性。

Smart-Plexer的目标之一是改进多重检测的分类。利用ADS和MDS，模拟多路复用可用于对每个组合进行排序，并为ACA分类器找到具有最大靶标间距离的最优分析。作者使用10倍交叉验证和k-最近邻(k-NN)算法来评估ACA方法的分类性能。每个多重检测的准确率从98.63%到100%不等。靶标间距离越大，ACA分类效果越好。

通过对排名靠前和靠后的引物组合生成的曲线进行可视化，排名靠前的检测可以看到靶标之间的曲线距离更大，有利于ACA分类（下图b-f）。依靠Smart-Plexer从单一荧光通道中选择多重检测，使用ACA方法在单个荧光通道反应中准确识别多靶标的可能性显著增加。

接下来，作者尝试利用Smart-Plexer开发一种最佳的7-plex检测方法，能够使用qdPCR在单个荧光通道中准确识别以下呼吸道感染(RTI)病原体:人类腺病毒(HAdV)、人类冠状病毒OC43 (HCoV-OC43)、人类冠状病毒HKU1 (HCoV-HKU1)、人类冠状病毒229E (HCoV-229E)、人类冠状病毒NL63 (HCoV-NL63)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)。为每个靶标设计了至少两种不同的检测方法，七种病原体共有24种单一检测方法。每个引物组用其相应致病靶点的合成DNA进行检测。对得到的原始曲线进行处理、拟合并传递给Smart-Plexer以计算所有可能的7-plex组合(N = 4608)并计算其ADS/MDS。作者将二维空间中可视化ADS和MDS分为五类，用qdPCR方法进行实证检验:BOT (N = 6)、MID (N = 6)、BEST (N = 6)、TOP-ADS和TOP-MDS (N = 6)。结果表明，计算机模拟与实验检测结果相关系数为0.99（下图b）。此外，与BOT相比，BEST组合在聚类方面表现出明显的分离(与3-plex结果一致)，性能显著高于BOT组合，准确率提高了39.42%。

下图e报告了每组多重检测的精度和标准差，BEST组合组使用k-NN分类器的平均(±标准差)分类性能为95%(±0.04%)，是所有组中平均值最高和标准差最低的。表明Smart-Plexer确实提供了一个强大而可靠的解决方案，显着提高为数据驱动复用(即ACA方法)选择最佳复用的可能性。

开发的7-plex用于临床多病原体鉴定。作者选择了对合成DNA (PM7.2151) ACA分类准确率最高的多重组合。如下表所示，采用ACA方法对14份阳性样本进行qdPCR分类，所有病原体目前都被高置信度鉴别出(中位数= 95.46%)。结果显示Smart-Plexer可以利用数据驱动的多路复用能力，成为一种易于开发、强大且经济高效的分子诊断解决方案。

在这项工作中，作者使用一种名为Smart-Plexer的简单工作流程，重新设计了开发和设计多路检测的过程，该工作流程将单路检测的经验测试与计算机模拟相结合，以开发优化的多路组合。Smart-Plexer分析扩增曲线之间的靶间距离，生成最优的多重PCR引物，用于准确的多病原体鉴定。在本研究中，使用优化的多重PCR方法，应用Smart-Plexer方法对7种呼吸道感染目标检测进行了评估。经证明，单通道多重检测与最近发表的数据驱动方法——扩增曲线分析(ACA)能够对七种常见呼吸道感染病原体的单次检测中所需靶点的存在进行分类。Smart-Plexer通过为多路分析开发提供一个易于使用的框架来解决这个问题，实现高水平和高精度的数据驱动多路复用。

Smart-Plexer提供了一种利用湿实验室和计算机模拟开发多重检测的解决方案。一些湿实验室实验的要求在人员培训和时间要求方面限制了它的应用。为了进一步验证Smart-Plexer方法的实际应用，未来可使用不同的平台(如qPCR)和更大的临床样本队列，以确保Smart-Plexer满足临床诊断中高通量复用和敏感检测方法的要求。未来的工作将集中在开发这种检测的完全自动化上。本研究的另一个未来方面是进一步增加靶间曲线形状差异。一个例子是基于探针的化学，其中修改扩增曲线形状可以通过改变荧光探针的浓度水平来实现。这样可以扩大扩增曲线的靶标间距离，简化ACA分类，同时具有更好的聚类性能。这项工作将扩大ACA方法的应用范围，并显著提高其灵活性和可扩展性。