血清生物标志物的检测是诊断、预后、预测未来疾病和监测治疗反应的最常用方法之一。60多年来，生物化学一直被用于帮助诊断各种疾病，包括癌症、妊娠和心脏病。为了提高疾病检测的特异性，多种生物标志物检测已经被开发出来。所采用的许多方法依赖于抗体对表位的识别和每个分析物的相关光学读数，例如ELISA，它可以检测到pM水平的分析物。其他方法使用DNA适体，它允许在单个样品中检测多种蛋白质，灵敏度低至125 fM。 临床诊断现在已经超越了蛋白质生物标志物和基因检测。一个例子是microRNAs (miRNAs)，。miRNA表达的改变已经在广泛的临床领域被发现，如心脏病学、肝病学、肾脏病学、神经学、肿瘤学和血管疾病。这些分子主要是通过RT-qPCR在血液中检测到，但需要多个步骤，并且可能会在测量中引入偏差。因此，非常需要开发能够对各种分析物进行高度多路检测的技术，包括核酸、蛋白质和小分子。单分子纳米孔传感为完成这项任务提供了理想的平台。分子通过纳米孔的易位会引起离子电流的变化，而离子电流的变化取决于分子的电荷、大小和构象。然而，这种方法通常缺乏选择性。 近日，一组来自伦敦帝国理工学院和牛津纳米孔科技有限公司的研究团队在杂志Nature Nanotechnology上发表了一篇题为“Nanopore sequencing of DNA-barcoded probes for highly multiplexed detection of microRNA, proteins and small biomarkers”的文章。本研究将纳米孔测序与DNA条形码分子探针相结合，展示了一种多路分析物检测策略。该平台可同时定量检测至少40种分子，包括miRNA，蛋白质和其他小分子如神经递质。每个分析物的存在是由每个探针通过纳米孔时的易位动力学决定的。所建立的方法易于适应和扩展，这意味着检测到的生物标志物的数量可以扩展到覆盖多种疾病。该检测要求样品体积小于30 μl，不需要样品标记或扩增，成本低于100美元。由于实验方案的简单性、平台的可移植性和快速周转时间，相信这种方法可以对当前的诊断产生广泛的影响。
图片来源：Nature Nanotechnology 分析物的多路检测策略 通过将纳米孔测序与选择性结合目标分析物的条形码分子探针相结合，实现了高度复用的检测策略(图a)。条形码探针由三个关键区域组成:(1)adapter;(2)条形码;(3)靶结合区(图b)。条形码序列作为一个唯一的标识符，目标结合区可以是互补序列(结合miRNA或DNA)，也可以是适体(结合蛋白质和小分子)。由于纳米孔的几何形状不允许双链或蛋白质/小分子通过纳米孔(图c)，有靶标结合的杂交探针的易位被减慢，可以通过有或没有延迟对事件进行分类(图d)。
使用条形码探针和纳米孔测序的多路检测策略。 图片来源：Nature Nanotechnology 核酸条形码的精确检测 作者首先设计了40个独特的条形码探针来检测与心脏病有关的miRNA，在没有目标分析物的实验中确定条形码碱基检测和分类的准确性。作者测试了一系列阈值，最后确定最佳阈值:错配碱基总数≤5个；前10个碱基1个错配；一共≥15个碱基对齐；序列以“GGG” '开头(AUC = 0.805)。这种配置没有提高灵敏度，但显著降低了假阳性率(FPR)。优化的阈值导至单个条形码探针实验中碱基检测对齐的准确性>95%(图c)。为了确定平台的灵敏度，作者对另外两个具有一个和两个错配碱基的探针测试了条形码。在所有三种条形码探针存在的多路复用实验中，正确条形码的比对得分明显高于其他序列的比对得分(图d)。
核酸条形码的精确检测。 图片来源：Nature Nanotechnology 条形码探针与miRNA杂交 为了验证序列特异性miRNA检测，将40个条形码探针(30 nM)与每个miRNA (10 nM)分别孵育(图a)。结果发现，当存在相应的靶miRNA时，每个条形码探针的延迟事件百分比显著增加(P < 0.01)。所有分类中真阳性比例为2.65%，假阳性为0.95%，假阴性为0%，真阴性为96.40%(图b)，平台准确性为99.05%，特异性为99.02%，敏感性为100%。
单个miRNA检测的灵敏度和选择性。 图片来源：Nature Nanotechnology 多重检测miRNA 将条形码探针与合成的miRNA孵育，以确定在多路复用条件下是否可以观察到事件延迟(图a)。结果发现，当miRNA存在时，延迟事件的平均百分比增加(图b(i))。在不进行解复用的情况下，发现延迟事件百分比在0.1 nM至10 nM之间呈线性增加，随后出现平台期(图b(ii))。使用校准流程对信号进行解复用，对每个探针构建浓度-百分比延迟曲线(图b(iii))，以确定miRNA的浓度，并与实际浓度进行比较(图c(i))。结果显示，所有预测的准确度都在真实浓度的一个数量级之内。
miRNA的多路检测和定量。 图片来源：Nature Nanotechnology 多重检测miRNA、蛋白和小分子 由于其适应性，该平台具有在单次实验中同时检测蛋白质、miRNA和小分子的潜力。在单条形码探针实验中，当其病理生理浓度对应的蛋白存在时，可观察到易位时间显著增加：凝血酶(图a); b型利钠肽(图b);心肌肌钙蛋白T(图 c);和心肌肌钙蛋白I(图d)。这与延迟事件百分比的显著增加相对应，表明该方法可以检测蛋白质。此外，当血清素(150 nM)与其相应的条形码探针孵育时，也能观察到易位时间和延迟事件百分比显着增加(图e)。 当进行小分子与miRNA的双重检测实验时，50 nM小分子和≥3 nM miRNA的条形码探针孵育显著增加了每个探针延迟事件的百分比(图f)。作者还进行了miRNA、小分子和蛋白同时观察的三重实验。当存在miRNA(≥10 nM)、小分子(≥150 nM)和蛋白质(≥50 nM)时，每个条形码探针的延迟事件百分比比对照组显著增加(图g)。
蛋白和小分子的检测。 图片来源：Nature Nanotechnology 人血清中miRNA的检测 对8名健康参与者的血清进行了40种miRNA（心血管疾病相关）的检测，并与阴性对照(缓冲液)进行了比较。在三个独立的实验中，八个参与者样本中所有miRNA(未解复用)的平均百分比延迟都增加了(图a)。当信号被解复用时，可以观察到miRNA百分比延迟的显著变化(图b)。在测试的40种miRNA中，发现所有8名参与者中有24种miRNA相比阴性对照显著增加(图c)。所有样本中最常观察到的miRNA是:miR-1233-5p、miR146a-5p、miR211-5p、miR30c-5p、miR18a-5p、miR-126-5p和miR193b-3p，与RT-qPCR实验结果一致。
人血清中miRNA的多路检测。 图片来源：Nature Nanotechnology 总结与讨论 数据表明，条形码探针，结合ONT测序平台，提供了一个高度准确和敏感的分析物传感平台，具有单分子分辨率。作者在同一样品中检测了40种不同的条形码探针，并构建了独立的浓度-延迟曲线，然后在单盲实验中使用这些标准曲线来预测miRNA浓度。多路复用方法可应用于多种分子，使我们能够观察到由于蛋白质和小分子(以及miRNAs)引起的延迟事件百分比的增加，且该平台与人类血清兼容，表明其作为生物标志物检测平台的潜力。 在平台当前配置下，分析时间可以少于60分钟。与其他需要几个小时甚至几天才能完成的技术相比，这是一个明显的进步。ONT测序软件允许实时解复用，这将进一步减少分析时间，并在检测半衰期短的分析物方面提供关键优势。此外，由于MinION设备具有高度便携性，因此可以在远离诊所的地方进行检测。目前，该平台对miRNA的检测限约为50 pM。通过降低对齐的假阴性率，有可能进一步推动这项技术。测定血清的一个特殊问题是纳米孔腔很小，很容易被蛋白质阻塞。为了堵塞，作者增加了一个过滤步骤，去除最大的血清蛋白(>10 kDa)。在未来的应用中，最好进一步发展此方法，以减少检测前处理，同时减少不必要的孔隙阻塞。在限制蛋白水解的同时防止miRNA降解是开发一种能够同时检测血清中蛋白质和miRNA的检测方法时需要克服的关键障碍。 该平台显示出在临床环境中使用的巨大潜力，例如，提供广泛的、纵向的疾病跟踪或早期疾病检测。该测定法可适用于多种复杂的液体，例如唾液、尿液和脑脊液。通过进一步优化，该策略可以显著减少检测时间、分析成本和样本量，同时增加临床医生可用的数据。
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