单细胞基因组学是将高通量测序技术应用于单个细胞。自 2009 年第一篇单细胞测序论文发表以来，单细胞技术的进步飞速，得益于能够同时进行数万个细胞并行生成高精度数据的产品的开发和商业化。 现在有大量的单细胞实验方法用于检测不同的基因组及转录组特征，包括 DNA 甲基化、染色质可及性和其他表观遗传标记。随着单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和单细胞 DNA 测序 (scDNA-seq)等方法越来越普及，大家普遍的关注点转向为：这些何时能用于临床转化？ 基因测序应用于临床的最典型场景就是开发基因组信息指导的诊断。这通常涉及从患者的大量组织样本中生成 DNA 或 RNA 序列信息，并对其进行分析以确定可用于诊断、预测或告知临床管理的特定信息。术语“批量bulk”是指从大量细胞共同生成基因组数据的方法，或者从源自许多细胞的cfDNA中生成基因组数据的方法。因此，过去的精准医学代表大量细胞的平均信号。 尽管批量的基因诊断方法已经在进入临床实践，但批量分析无法揭示细胞之间的基因组差异。这一点又很关键，因为大多数系统在细胞之间具有显着的基因组异质性。细胞异质性的例子有很多，包括由肿瘤体细胞突变引起的克隆多样性、肿瘤浸润免疫细胞之间的基因组变异、T 和 B 细胞的不同克隆性群体等。这些导至了千差万别的临床特征和不同结局，包括诊断率低、治疗效果不一、长期预后差等等。 已经有诸多的单细胞基因组研究表征并阐述了临床相关的细胞异质性，以及这些如何被利用来改善临床实践。理论上讲，毫无疑问，同时确定数千个单个细胞的基因组图谱在临床应用上具有无限开发潜力。 截至去年底，已经有 62 项使用单细胞基因组学方法的肿瘤学、血液学和免疫学注册临床试验中应用。这些试验中的大多数都具有探索性目标，例如发现与标准治疗试验一起使用的生物标志物或改进疾病的诊断和亚分类。尽管探索性研究仍然至关重要，但明确关注scRNA-seq的实际应用及其在诊断环境中使用的可行性的试验无疑将最有可能推动其在临床实践中的应用。
有趣的是，目前大多数试验使用 scRNA-seq 或 scRNA-seq + scDNA-seq的组合，这可能反映了技术的成熟度，特别是在肿瘤学和血液学中。值得注意的是，这些临床试验中的大多数 (85%) 是使用血细胞进行的，或者在实体瘤中使用血液和肿瘤细胞的配对样本进行。这部分原因是实体组织分离仍然存在挑战，尽管使用配对样本将使验证研究能够减少对实体组织活检的要求。 评估单细胞测序辅助诊断和识别可靶向突变以推动治疗决策的能力的临床试验对于将其转化为临床实践至关重要。这可能将逐渐成为临床试验设计的一个固有组成部分。
随着研究结果的不断出现，单细胞分辨率的基因组测序逐渐加深了我们对血液学和实体器官恶性肿瘤的理解。它绘制出肿瘤异质性和微环境，确定联合治疗的多个靶点，预测对治疗的反应和毒性，并深入了解治疗耐药的机制。单细胞测序在开发自身免疫性疾病的精准治疗以及患者分层、疾病监测和准确诊断方面显示出希望。
单细胞测序平台需要制备单个细胞的悬浮液。无论下游分析类型如何，细胞分离技术都是相同的，因为 DNA 与 RNA 相比具有更高的稳定性，所以scDNA-seq 对细胞制备工作流程的变化更加稳健。针对单个组织类型的简化、经过充分验证的操作流程对于临床转化至关重要。大多数组织类型现在都存在基于研究的方案，但很少有实体组织细胞制备方案在临床工作流程中得到验证。 有许多方法可用于 scRNA-seq。然而，对于临床实践，平台必须不断发展，变得更加用户友好、高通量和具有成本效益。用于从细胞中捕获 RNA 的技术可分为微流体或基于板的方法，具体取决于细胞的分离方式。它们在成本、每次实验的细胞数量和易用性方面各不相同。除了捕获方法和涉及的细胞数量外，微流体方法和基于板的方法之间的关键区别之一是它们生成的转录组覆盖率。 scDNA-seq 使研究人员能够读取基因组并识别单个突变，例如细胞水平上的拷贝数变异和单核苷酸变异。与 scRNA-seq 相比，scDNA-seq 技术还不够成熟，目前市场上的商业解决方案较少。 目前，10x Genomics 和 Mission Bio 等单细胞技术开始出现在临床实验室中。在质量控制框架内对这些技术进行标准化和认证对于结果的可靠性是必要的。单细胞方法必须与当前应用程序的当前黄金标准测试进行比较。例如，需要将 scRNA-seq 在识别微小残留病 (MRD) 方面的灵敏度和特异性直接与短串联重复 (STR) PCR 的当前检测水平进行比较。 一旦生成序列数据，就应用标准生物信息学流程来转换原始数据并提取临床相关信息。这些步骤通常构成验证和监管框架的一部分。在大多数情况下，这些计算管线也能适用于临床环境，但与分子工作流程一样，它们将需要在当地认证框架内进行验证。此外，越来越多的开源参考数据集（例如人类细胞图谱）将有利于生物信息学程序的验证并增强细胞识别和分析。 然而，当前发表的单细胞基因组学文章仍然稳固地存在于研究领域。在转化进入临床实施之前，上面所提到的这些环节中存在的障碍也必须被克服。 新鲜组织活检样本必须快速处理以进行细胞测序，通常在数小时内完成。这将需要临床病理学实验室从福尔马林固定的范式中转变出来。 此外需要对设备和人员进行前期投资以实现细胞捕获和测序，并且还需要员工培训和认证以满足严格的质量要求。 以可重复、省时的方式处理数据仍然是临床采用细胞技术的一个重大障碍。为了使结果可重现，实验室必须具有标准的细胞过滤和标准化过程。此外，使用参考数据集的自动细胞分类将确保可靠的结果。在大多数国家/地区，新技术在国家管辖框架内进行标准化和验证，并且灵敏度和特异性以当前的黄金标准测试为基准。 将大量细胞基因组数据浓缩成清晰、简明和临床可用的报告将是必不可少的。全外显子组测序在肿瘤学中已变得司空见惯，并且有几个指南示例可以帮助实验室为临床医生定制报告。尽管细胞领域将面临新的挑战，但由于报告还必须考虑细胞异质性，目前可用的指南将提供一个有用的框架。 单细胞技术的成本目前相对较高，但从全外显子组测序中看到，这些成本随着时间的推移而降低。随着这些方法被纳入临床，希望也看到单细胞的技术、方法、试剂及分析计算的成本都不断降低。 目前单细胞学科的大多数仍处于临床研究阶段，下一个发展阶段必然是将单细胞技术从实验研究转移到临床试验，并通过实际应用来评估可行性和有效性。此外，单细胞测序用于确定新治疗靶点的研究也会逐渐转化为药物开发实践。 这可能关于这项技术在未来十年绕不开的讨论话题。 以上信息均来自于公开可获取的内容；本文只代表个人的观点，不包含任何投资建议；文中信息不当或不准确的地方，欢迎留言或私信指正。文章附图来自于公开可获取的渠道，若涉及隐私及保密信息或若有侵权请联系删除。 |
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