蓄“4”待发，一文详解第四代基因测序技术

基因测序，即通过对生物体的核酸序列进行检测，从而在分子和基因层面实现对生物体的进阶分析与解读。对于人类而言，究其根本都含有23对染色体、2.5万个基因编码、30亿个碱基对组成的bio-data综合体。通过对基因层面的解析，我们得以高效的探究自己身体内终极密码。

基因测序最初走进大众视线，凭借的是名人效应。乔布斯曾经花费10万美元进行癌症全基因组测序技术，在获得了个人基因组的信息后，医生为他开出相对精准的抗癌方案，使其面对胰腺癌这个“癌中之王”又带病生存了近10年。著名影星安吉丽娜朱莉通过基因检测了解到自己有87%的乳腺癌患病概率后，毅然选择了预防性手术。

现如今，基因测序不再是少数精英阶层的专利，技术的快速迭代、测序成本的持续降低将这项技术带到普通人的身边。

全球疫情的元凶SRAS-CoV-2病毒也是通过NGS技术而被中国科学家率先确定。在收到最初的病例标本后，国内几家病毒专业研究实验室平行开展了全基因组测序，均发现送检样本中存在同一种新的未知的冠状病毒基因组序列，该冠状病毒序列为主要病毒序列，且该基因组序列在健康人群和其他类型的肺炎患者中不存在，NGS技术为确定病原迈出了关键的一步。

测序仪器为什么是行业的“兵家必争之地”

测序是解开人类生物密码的基础，也是生命科学发展的基石。现在的测序技术已经应用到医疗检测，指导临床，寻找与疾病相关的基因突变信息等方面。测序领域发展迅速，其应用前景十分广阔，市场价值不可小觑。

但从产业链的角度分析，我们会发现情况并不乐观。基因检测产业链分为上中下三个环节：上游主要负责测序仪的研发，核心技术掌握在Illumina、华大等少数几个大企业手中，呈现出垄断的态势；在整个基因测序的产业链中，上游技术要求最高，原因在于上游端测序平台需要掌握的核心技术包括 DNA 聚合酶、DNA 提取富集技术、光电技术等，因其整体性和复杂性形成技术壁垒。因此基因测序产业链上游的企业相对较少，市场份额集中。

2019 年全球基因测序上游市场份额（%）

中游提供检测+生物信息分析的测序服务，如诺禾致源、安诺优达等等一众公司，提供测序服务的门槛并不高，目前中游公司数量最多，竞争激烈，但拥有注册证产品的公司较少；下游临床、科研等终端用户。

目前五花八门的基因测序产品，主要围绕在产业链中下游，在已有的基因测序仪的应用层面展开激烈的市场竞争。而真正的行业命脉是上游市场，极高的技术壁垒，成为众多中下游基因测序企业的发展痛点，大家肯定会记得当年华大被卡脖子，后来发愤图强的往事。

国内外基因测序市场正以前所未有的速度增长着，各种基因测序产品和服务层出不穷。然而基因测序的高度专业性，决定了技术壁垒将始终是行业痛点，缺少核心技术的国内基因检测企业，绕不开技术的引进和同质化产品的竞争。

走出基因测序产业下游的竞争红海（典型的如诺禾致源，各位看官可自行搜索），引领技术革新是关键。所以测序仪器是行业玩家的命脉，想要在未来占据主动权，必须要拿下这颗“皇冠上的明珠”。

接下来让我们简要回顾一下测序技术的发展。

测序技术的前世今生

近半世纪以来，基因测序技术飞速发展，从一代发展至四代，发生了日新月异的变化：

第一代测序

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解），为方便起见，统称为Sanger法。在1977年，Sanger测定了第一个基因组序列——噬菌体phiX-174，全长只有5,375个碱基。

虽然与今日的技术比起来根本不算什么，但自此之后，人类获得了窥探生命本质的能力，并以此为开端真正步入了基因组学时代。Sanger法的核心原理请自我学习，本文不再赘述。

总的来说，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1,000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本偏高（相对基因组大小），通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是理想的测序方法。

第二代测序

二代测序技术在大幅提高了测序速度的同时，还大大地降低了测序成本，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但其序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。

目前illumina的测序仪占全球75%以上，以NextSeq、HiSeq、NovaSeq等系列为主。它的机器采用的都是边合成边测序的方法，读长短（50-300bp）；准确度达99.9%；通量很高。

此外还有如日中天的华大智造，大家可以自行搜索招股说明书一探究竟。

但是第二代基因测序技术的局限性也显而易见：一是需要分子扩增，二是使用光学系统检测，三是必须有足够多的样本才能降低测序成本，这些部分限制了基因测序的推广，阻碍其走向产品和服务的基因消费时代。

但其技术硬伤还在于：1、读长短的缺点导至测序过程中含量较少的序列信息可能会丢失，且PCR过程中有一定概率会引入错配碱基；2、想要得到准确和长度较长的拼接结果，需要测序的覆盖率较高，导至结果错误较多和成本增加。

第三代测序

以PacBio公司的SMRT单分子测序技术为代表。与前两代相比，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，是二代测序技术的100倍以上。这种纳米孔单分子测序仪还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。

SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但这么快的测序速度也带来了一些明显的缺点——测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），可以达到10%-15%，而且以随机的缺失序列和错位居多。

总之三代测序设备在DNA 序列片段读长上优于二代设备，但在准确度上较二代设备差，此外单样本的测序成本一直居高不下。

第四代测序

以Oxford Nanopore Technologies为代表的纳米孔测序技术与其他测序技术不同的是，它基于电信号而不是光信号。经历了三个主要的技术革新：一、单分子DNA从纳米孔通过；二、纳米孔上的酶对于测序分子在单核苷酸精度的控制；三、单核苷酸的测序精度控制。

将在某一面上含有一对电极的特殊脂质双分子层置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔（直径2.6nm），只能容纳一个核苷酸通过，并且每个纳米孔会结合一个核酸外切酶。当DNA模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，从而进行实时测序，最终得到DNA分子的序列。

Oxford Nanopore的特点是单分子测序，测序读长长（超过150kb），测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等，但其单芯片测序成本还是在几百美金以上。

现有的四代测序技术还有哪些痛点

测序技术在不断进步中，进步的目的是要解决目前还没有完美答案的问题，比如四代测序在长读长、速度上已经大幅领先，那接下来首要的就是成本问题，无论是仪器成本，还是测序成本等，其它的次要因素还有数据通量、速度等。

是时候祭出这张经典的测序成本变化图，其含义再明显不过了：成本是技术广泛应用的决定性因素，这句话出自上周末国产四代测序厂商安序源的新品发布会，笔者深表赞同，毫无疑问，测序技术大规模商业化应用，就是成本因素在制约着。

• 低成本

怎么做到的呢，就是下图的纳米孔测序晶圆，说人话就是芯片。大家知道芯片的迭代速度非常快，而且安序源的硅基纳米孔芯片的通道数为100万个，远远超过市面上的所有四代测序玩家，比如ONT目前最新的芯片纳米孔通道数才为2675个，而按照在发布会上的说法：安序源的下一代的芯片通道数将是目前的10倍，也就是1000万个纳米孔。同时单张芯片的测序成本低至0.3美元/G（RMB 2.1元/G），数据通量最高达100Gb，看到这里，友商们可能已经哭晕在厕所。

•  测序精度

这是笔者比较关心的另外一个问题，因为这也是决定测序仪应用场景的核心性能指标。虽然对安序源的技术一知半解，但结合发布会和查资料，有技术大拿推测安序源应该是通过环化测序，然后再共识算法（一致性算法）来提高纳米孔测序准确度，也就是通过RCA（滚环复制）生成DNR（DNA Nano Roll，DNA纳米卷），然后通过CCS（circular consensus sequencing，环化连续测序）多次测序突破原有的纳米孔测序精度极限。

同时，据发布会介绍，安序源同步在开发高精度的单次测序模式，公司宣称已在特定测序化学系统中的测序精度可达到单分子单碱基单次Q40（衡量碱基测序准确度的质量值，Q40下，错误识别的概率是0.01%，即错误率0.01%，或者正确率是99.99%），这样的数据怎么说呢，刮目相看！

• 实际表现

根据亿康基因产品研究总监万成博士测试数据，安序源的AXP100-RS在16S RNA基因测序中的物种丰度与其它测序平台保持一致，所以目前看起来经受住了真实世界的考验。当然笔者也期待有更多的测试数据能分享出来，毕竟是骡子是马得牵出来溜溜。

最后以安序源AXP100-RS新品发布会上一张酷炫图做为结尾，也期待安序源真机早日量产，利用技术优势降维打击，弯道超车，客户也能用国产四代测序平台“任性一把”。

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