大家好！我是山火，一枚侧向层析和分子POCT产品开发。一直很好奇，牛人是怎么做产品的，他们是怎么想的，哪些因素成就或者耽误了他们。最近翻阅故纸堆时发现些有趣的人和事，跟大家分享下。欢迎大家留言或加我微信交流（微信号：lishi_y ）。
 “有严格方法论的人很少研究DNA。一个令人耳目一新的例外是卡尔·维特沃......卡尔对PCR的思考方式是其他人很少有的，他的想法清晰而实用。”——摘自PCR技术的发明人、1993年诺奖得主Kary B. Mullis书籍《Polymerase Chain Reaction》序言卡尔·维特沃（Carl Wittwer）是Biofire的联合创始人，也是学术界大牛。他是犹他大学医学院病理学教授（2020年退休），还是检验医学头牌杂志《Clinical Chemistry》的副主编。迄今发表过200多篇文献，学术成果斐然：
2015年他还搞出了Extreme PCR（极限PCR?）技术，可以用14.7秒高效完成35个扩增循环。最牛的是，他的多数学术成果，都转化成了产品。更牛的是，他在PCR这条路上走了30多年。成长经历卡尔·维特沃出生于1955年，他回忆说小时候父母对他的管教极其宽松，青少年时期他喜欢在自家地下室里拆装电器或者用邮购的化学品制作烟火。可能由于父亲是化学家，他很早就对化学产生了兴趣。1977年他从犹他州立大学化学与生物化学专业毕业后，先在密西根大学医学院工作并于1982年获得医学博士学位。博士期间他的课题是泛酰巯基乙胺酶的提纯与表征，因为讨厌每次做完实验都要花两天时间去表征实验产物，严重耽误后续的实验优化。他开始研究如何加快测试速度，花了一年多时间把分析测试的时间从2天缩短到了15-30分钟。这是他追求测试速度的起源，这个过程中，他接触到了流式细胞术。卡尔·维特沃特别喜欢泡在实验室实现他的想法，他曾经特别喜欢滑翔伞运动，结果后来远离了这项运动，因为“几乎所有醒着的时间都是在实验室里度过的”。2001年46岁时，娶了跟他拍拖8年的日本裔生物学家Noriko Kusukawa，Kusukawa曾任犹他大学ARUP 实验室创新和战略投资副总裁。
Carl Wittwer和妻子Noriko Kusukawa2020年他65岁时，卡尔·维特沃和妻子都从犹他大学退休，搬到了他们认识时候所在的缅因州，还在家里建了一个配置齐全的分子生物学实验室。接受采访时他说退休后“我将做我喜欢做的事，以及我可能擅长做的事”。快速PCR仪 1982年博士毕业后卡尔·维特沃到犹他大学流式细胞术实验室工作，1988年他已经是犹他大学病理学系助理教授，因为要为他所在的ARUP参考实验室寻找新技术，他开始接触到PCR。
卡尔·维特沃展示机器原型，左边为联合创始人Randy Rasmussen在用黑胶唱片机、吹风机和真空吸尘器制作了仪器原型并多次迭代后（有一次演讲上，他说公司成立前迭代了5-10次，成立后又迭代了3次）。1990年，为了将原型商业化，他跟朋友Kirk Ririe 和 发小Randy Rasmussen一起创立了Idaho Technology, Inc.，也就是后来的Biofire。这两个名字，都能够从八年前卡尔·维特沃的博士论文致谢部分找到。当时他从犹他大学获得使用自己研究的许可（有的资料提到，Idaho是犹他大学的校企，也许就是技术入股？），因为这个Idaho还从美国国立卫生研究院拿到了一笔STTR小额技术转让研究拨款。Kirk Ririe最初学的是通信，是他犹他州州立大学的校友。创业前在家里的生产土豆收割机滚筒的工厂帮忙，Idaho最初的办公地点就在这家公司。后来2005年还获得了犹他大学的化学学士学位，导师就是卡尔·维特沃。Randy Rasmussen是分子和细胞生物学博士。他们三人后来都担任过Biofire公司或者子公司的CEO或者董事长，合作多年。后来Biofire的大卖特卖的分子POCT平台FilmArray采用的柔性塑料袋，是Kirk Ririe设计的，据说是他在麦当劳陪娃时候，从挤番茄酱获得的灵感。创业当年他们推出了Air Thermocycler，这是第一台快速PCR仪，可容纳 48 个样品管和 4 个循环程序，在20分钟内完成 30 个循环。凭借这款独家产品，Idaho从创业当年就开始盈利。罗氏通过会议知道了他们，找上门来拿下了他们机器的全球分销权。跟赛沛一样，Biofire也做生物防御检测。2014年被梅里埃收购后，分拆成BioFire Diagnostics和BioFire Defense两个子公司，BioFire Diagnostics做诊断，BioFire Defense做生物防御检测。两家公司貌似是同一批高管，办公地点相隔不过10公里，另外从新冠期间产品的情况看，两家子公司的分工似乎是一家负责研发一家负责生产。熔解曲线、高分辨率熔解曲线分析最初的PCR实验结束后需要开管跑凝胶电泳，那一代研发人员一直在孜孜不倦的寻求不需要开盖的方法。1993年，Cetus公司的Russ Higuchi和同事偶然发明了荧光定量PCR。当时采用的染料是EB（溴化乙锭），一个循环获取一次荧光信号。卡尔·维特沃最先将流式细胞术里的SYBR Green I引入到PCR中，替代EB。为配套SYBR Green I检测，他把流式细胞仪光学元件引入到PCR中，以实时监测 PCR过程。1996年，Idaho推出荧光定量PCR仪LightCycler，第一版刚推出，罗氏就收购了这款产品的多种权限。
在调整流式细胞仪的光学系统时候，通过连续获取荧光和温度信息，他们偶然观察到DNA熔解现象。直接就将原本需要数小时，采用紫外线吸光度测量的溶解曲线分析缩短到几分钟。再后来，又一次偶然发现，使用一个探针就可以进行基因分型，他们更进一步简化了熔解曲线分析方法。但卡尔·维特沃觉得熔解曲线质量并不高，很难检测到微小差异。2000年，他启动高分辨率熔解曲线分析仪的开发，他想知道，如果把溶解曲线做的更精细能获得哪些额外信息。期间他们合成了30多种染料，通过新的仪器、新的软件和新的染料，最终成功开发出高分辨率熔解曲线分析方法。新开发的方法具有极高的灵敏度，甚至可以直接用染料而非标记探针准确地区分单碱基突变。Extreme PCR-打破共识“他只相信他自己在实验室做出来的东西。”“而且别人认为理所应当的事情他从不想当然，他总是在研究基本假设”。——Biofire联合创始人 Randy Rasmussen2010年左右，经过了20多年发展，而且PCR的很多核心专利已经过期，PCR仪的温度循环已经很快，但是采用快速循环的PCR效率很低，灵敏度明显下降。在完成了诸多发明之后，卡尔·维特沃又回到他接触PCR时候的第一个兴趣：提高PCR的速度。关于化学反应的速度，初中化学课本就介绍过：反应物浓度越高，速率越快。在PCR上，就是提高引物和酶的浓度。当时大家已经有了一个共识：引物和酶浓度，会导至或将导至非特异性扩增，反而降低PCR速率。没有止步于这个共识，卡尔·维特沃开始思考：有没有可能在提高引物和酶浓度的情况下保证特异性。他先系统研究了各种试剂和参数对PCR的影响，然后开始同时调整浓度和反应时间。在将引物浓度、酶浓度和镁离子浓度提高一个数量级，将二级反应变成了速度很快的伪一级反应后。开始慢慢缩短每个循环的时间，由于没有合适的扩增设备，他们又回到了水浴锅，将体积更小、壁更薄的毛细管在不同温度的水浴锅中快速切换。在将每个循环的时间缩短到0.4-0.6s时，出现了魔幻般的结果：特异性比常规PCR更好。也许因为温度切换太快，也许非特异性结合的反应速度不如特异性结合？反正，没有时间去产生非特异性产物。卡尔·维特沃实验室网站发布的Extreme PCR原型视频2014年，他们开发出Extreme PCR，采用薄壁毛细扩增管（1mm外径，0.8mm内径）或者19号皮下注射针（1mm内径，2mm外径）。采用常规的非热启动酶，0.4-2s一个循环，可在14.7秒将60bp的靶标特异性扩增35个循环。
Extreme PCR原型视频拍摄的是此图右上角部分为了实现这种极限变温速度，扩增设备也要重新开发。
卡尔·维特沃讲座PPT里的微流控薄片Extreme PCR专利是2021 年获得的，基于此技术的工程化（可能是薄片微流控形式），Biofire在2022年初推出了其小型化系统的BioFire SpotFire，可以在15分钟内完成检测，采用Extreme PCR扩增，用高分辨率溶解曲线分析读取结果。补充卡尔·维特沃实验室官网、Biofire官网、AACC官网上有一些卡尔·维特沃的采访录音和讲座文档，我整理了一些片段：他并不想做公司，但是想用PCR仪，所以只能商业化。新想法的核心过程只能来自个人，因为只有自己才会痴迷自己的想法，才会念念不忘去实现，团队则可以帮着拓展想法。因为创新只能来自于个人和个人实验室，所以不是要想办法控制他们，要发展创新生态系统，要给他们授权。思维的火花可能会闪电般的出现，要有足够的决心去逐步尝试你的想法。这是一个渐进的过程，可能会一遍遍的失败，但这个过程中，你会变得越来越好，也只有这个过程能真正产生发明。原型设计过程实际上是在实践中学习的过程，最后在实践中发明。工程师会按照被教导出来的方式建造东西，但外行可能会想出更新颖更便宜的实现方式。当公司越来越大，在系统、控制和质量控制方面可能会做的很好，但会失去破坏性创新的能力。在合作的过程中，要让参与的人都能从中得到收获，才能真正成功。梅里埃整合Biofire时，并没有把公司搬走，也没有裁员，还保留了高管。因为他们不仅对产品感兴趣，还对Biofire产生创新的生态系统感兴趣。最终成功的把Biofire这个小公司整合到了大公司。 后记 然后我个人印象最深刻的有两个方面： 卡尔·维特沃把做实验当成了爱好，退休后都还要亲自动手做实验。（难道因为对实验熟悉，能够从中发现别人发现不了的现象？）几个合作伙伴都是技术出身，一直没有闹掰，而且其中至少两位持续在做产品开发。很好奇卡尔·维特沃所说的创新生态是什么样的。 参考资料：卡尔·维特沃实验室官网（https://dna-utah.org/index.html）、Biofire官网、AACC官网、生物梅里埃官网、犹他大学官网、犹他大学ARUP实验室官网、犹他州州立大学官网、谷歌学术、维基百科 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
