基于CRISPR的微流控分析及应用研究综述

2023-5-18 14:17| 编辑: mango524| 查看: 1772| 评论: 0|来源: IVD分享库

摘要: 本文综述基于CRISPR的微流控检测方法的最新进展，以及对基于CRISPR的微流控检测方法在基于CRISPR的创新与微流控平台设计方面的未来趋势进行展望。

今天分享的话题是：CRISPR；微流控；纸基微流控；离心圆盘微流控；数字微流控；电化学；可穿戴设备微流体设备

前言

在过去的几年中，基于CRISPR的检测技术在生物分析，分子生物学和临床诊断领域都有了应用。然而，仍然存在一些局限性，例如成本高，技术要求高，交叉污染，不能定量等。微流控平台作为新兴技术，有可能在未来将基于CRISPR的技术提升到新的水平。本文综述基于CRISPR的微流控检测方法的最新进展，以及对基于CRISPR的微流控检测方法在基于CRISPR的创新与微流控平台设计方面的未来趋势进行展望。

学习目录

CRISPR系统和微流控技术简介
基于CRISPR的微流控系统检测方法概述
基于CRISPR的微流控检测方法的展望

1. CRISPR系统和微流控技术

1.1 CRISPR系统

作为新兴的基因编辑和调控工具，CRISPR系统具有高度的特异性、灵敏度和灵活性。除在基因编辑和改造方面有重要作用外，在传染病诊断、环境监测、食品安全检测等方面也有着良好的前景。随着CRISPR/Cas系统的深入研究，通过其高特异性识别目标序列和反式切割能力，已经建立了多种简便、灵敏的生物传感平台，解决了传统方法在操作、灵敏度、特异性及检测周期方面存在的不足[2]。

CRISPR/Cas系统由于优异的生物传感性能逐渐成为下一代诊断技术的焦点，有望成为开发理想诊断产品的方法。基于CRISPR/Cas系统的特异性结合活性和高效反式切割能力，将其与电化学、荧光传感技术相结合，已经成功实现了各种靶标分子的检测，检测对象也已经从最初的核酸扩展到金属离子、蛋白质、细菌、小分子等，说明了CRISPR/Cas系统在检测领域具有通用性。

1.2 微流控技术

微流控技术的概念被提出已有30余年，以“微型全分析系统”（μ-TAS）和“芯片实验室”（LOC）为主要形式。随着微流控技术的日臻成熟，逐步从前期技术攻关进入到产品商业化研发阶段，具有消耗试剂少、检测速度快、易于集成等优势，为其在临床检验领域提供了巨大的发展机遇[3]。

微流控技术指的是在微米尺度下对微小量级的流体进行精准操控的一种技术，可以实现多个实验流程在一块芯片上自动完成，具有低消耗、高效率、自动化、集成化、便携化等优势[3]。

在COVID-19大流行背景下，微流控技术在SARS-CoV-2即时检测中发挥了非常重要的作用，包括与核酸分析、免疫测定、电化学生物传感器等相结合的方法。微流体系统是自动操作装置，包含允许液体流动（10-100μm）的微通道，以及其他几个组件，包括微型泵、微型入口阀和微型出口排水管，以及用于分析内容物的不同设备。与传统的生物分析方法相比，它们有几个优点：（a）试剂消耗量少;（b）成本效益高;（c）操作简单，对训练有素的人员的需求较少;（d）周转时间快，适合紧急诊断;（e）样品产生较少的污染。（f）检测通量高。此外，微流控系统可以成为各种经典检测方法的通用平台，例如核酸分析，免疫测定，电化学方法，光化学方法、表面增强拉曼测定等。微流控检测方法似乎在未来继续快速发展，微流控平台有可能将基于CRISPR的技术提升到生物分析和临床诊断领域的新水平。本篇文献[1]作者讨论CRISPR-微流控的最新进展和应用，主要集中在微流控系统如何在降低成本、抗污染、操作简单、可视化、灵敏度和量化方面改进基于CRISPR的技术（图1）。

图1：基于CIRSPR的微流体的一般应用

2. 基于CRISPR的微流控系统检测方法概述

基于CRISPR的技术和基于微流体的系统在生物分析和临床诊断方面都具有出色的性能。下列表1，概述了基于CRISPR的微流控检测方法的最新进展【1】。

表1：最近基于CRISPR的微流控检测方法综述。检测限不能总是在各研究中直接比较，特别是因为一些研究没有报告LOD是如何确定的。n.s. 表示文章中未指定。μPAD是指基于纸张的微流控分析装置。LoaD 表示光盘上的实验室。DMF 表示基于液滴的微流体。

举例1：基于CRISPR的离心微流控系统，用于全封闭和集成分析（文献[1]作者团队的产品）

21世纪初，离心微流控平台的发展迎来了爆发式的进步。离心微流控芯片，也称为光盘实验室（LoaD），集成了试剂，混合，流量控制，反应和结果输入。LoaD最重要的功能之一是由离心力驱动的精确流量控制。离心微流控系统一般包括离心驱动源组件、液体分配通道、液体混合室、阀门控制系统、试剂储存室、反应室、信号输出装置等，自动实现样品预处理、纯化、反应和信号输出于一体。离心微流控芯片已经在免疫测定，生化分析和分子诊断领域表现出优异的性能。

离心式微流体系统有几个优点：（a）由于严格的模块分离和密封，交叉污染的风险最小。（b）试剂消耗少，降低了成本。（c）无需任何额外的手动操作即可实现进样和出样。（d）它是一种通用检测平台，受样品特性（如密度、pH、电导率等）的影响较小。（e）通过合理设计微通道可以实现多重检测。（f）在一次芯片测定中，可以依次进行多个级联反应，而不会相互影响。

到目前为止，大多数CRISPR检测方法都包含两个以上的步骤（提取，扩增和CRISPR检测）。在传统的CRISPR试管方法中，交叉污染和系统不相容是不可避免的，阻碍了其广泛应用。由于离心微流体系统的几个优点，它们是进一步利用CRISPR技术在临床应用中应用的有希望的候选者。

[1]复旦大学化学系孔教授课题组开发了一套用于生物分析和分子诊断的离心微流控平台（上海速芯生物微流控平台）。该平台包含多个模块，包括样品预加载、多个区域的精确温度控制、离心驱动模块、荧光信号采集和实时信号输出（图 2a）。该芯片主要由加样室、微通道和反应室组成。它可以同时检测4/8/16/32个样品，每个样品分为8/4/2/1反应室进行平行检测（图2b）。

如图 2.（a）该研究小组设计的辅助微流控装置。（b）微流控芯片的详细结构和流体通道。（c）样品液体在芯片中的流动阶段随着转速和时间的增加。（d）用于快速鉴别诊断SARS-CoV-2德尔塔变体的自动化Cas12a平台示意图。（e）长期储存过程包括冷冻干燥、密封、氮气保护和低温储存步骤。（f）双CRISPR / Cas12a辅助RT-RAA系统芯片中每个测试单元的结构和详细功能。（g）微流控芯片的工作流程和用颜色标记的芯片中微流体的状态[1]。

举例2：Xu等人设计了一种功能强大的RPA-Cas12a离心微流控芯片（MAPnavi），用于检测各种病原体。

3. 基于CRISPR的微流控检测方法的展望

基于CRISPR的检测方法由于其高灵敏度、特异性、稳定和普适性，在全球Covid-19大流行时代表现出色。然而，过度依赖扩增、缺乏定量策略和复杂的操作限制了其在生物分析和临床诊断中的进一步应用。基于CRISPR的微流控平台技术将大大拓宽应用领域，提高检测效率。除了微流控系统带来的低试剂消耗、自动化、减少污染、高灵敏度和操作简单等普遍优势外，相应的微流控平台可以打破基于CRISPR的检测的一些限制。例如，可视化、简单操作和即时检测可以通过基于纸基的微流体系统来实现。封闭的微流体系统可以减少污染。在离心微流体系统或电化学微流体系统的帮助下，核酸提取和分离等预处理步骤可以完全集成到测定中。数字微流控提供了很好的绝对定量策略并提高灵敏度。可穿戴微流体甚至可以为基于CRISPR的检测增加实时监测能力。

基于CRISPR的微流控方法的未来发展将侧重于基于CRIPSR的检测和自适应微流控平台的创新。进一步优化反应体系和设计新的CRISPR检测方法，特别是无扩增方法，在提高灵敏度和简化反应体系方面仍然具有重要意义。基于CRISPR的检测方法对于其他生物标志物如蛋白质、酶也可以与微流控平台集成。如何将现有的检测方法与合适的微流控技术相结合，以实现更好的自动化和更好的性能是另一个主要问题。需要越来越精湛的流道设计和配套的仪器设备来满足实际需求，我们相信基于CRISPR的微流控技术将在未来的检测和诊断领域开辟一个新的领域。

参考

[1]Li P, Xiong H, Yang B, et al. Recent progress in CRISPR-based microfluidic assays and applications[J]. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2022: 116812.

[2]孙秀兰,付旭冉,鲍琦,孙嘉笛.新一代诊断技术：CRISPR系统及其在分子诊断中的应用[J].食品与生物技术学报,2022,41(07):57-70.

[3]李恒,史烨萍,周思达,李警予,冯宇,李含,宋梦慈,贺志安.微流控技术在临床检验中的应用进展[J].科技创新与应用,2021(11):188-190.

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