识别和量化蛋白质生物标志物是精确和个性化医疗的迫切需求。生物流体中蛋白质检测的一个持续挑战是检测试剂与固定表面和蛋白质识别元件的非特异性结合的发生，从而放大背景噪声。此外，由于在低分析物水平下信噪比不理想，现有技术不能用于宽的动态范围。因此，越来越有必要创造高度特异性和敏感性的蛋白质传感方法。 在过去的十年里，使用纳米孔传感器的肽和蛋白质分析已经取得了实质性进展。纳米孔传感元件可以以单个氨基酸的分辨率识别和量化肽，用于揭示蛋白质的关键特征，如形状和大小、翻译后修饰、酶活性和机械折叠。但这种方法需要靶向蛋白质分配到纳米孔内部。检测纳米孔外的单个蛋白质，需要一种共价连接到纳米孔上的外部蛋白质结合基团（例如受体）以及一种转导机制来将蛋白质分析物（例如其配体）的物理捕获和释放转化为传感器的特定电特征。 近日，一组来自美国的研究团队在杂志Nature communications上发表了一篇题为“A generalizable nanopore sensor for highly specific protein detection at single-molecule precision”的文章。作者使用模拟抗体的结合基团制成的传感元件，该结合基团与单体蛋白质纳米孔融合。通过这种方式，这种模块化设计显著地将纳米孔传感器的实用性扩展到许多蛋白质，同时保留了它们的结构、特异性和灵敏度。使用FN3SUMO、Mb4和Adnectin1单体分别作为针对hSUMO1、WDR5和EGFR胞外域的结合物，创建了三种传感器，并展示了纳米孔传感器实时无标记检测三种分析物的结果。 图片来源：Nature communications 纳米孔传感器的设计 研究团队设计了一类探测蛋白质的传感元件。这些传感器将类似抗体的蛋白识别元件（如蛋白质或肽）通过柔性（GGS）2肽链共价连接到tFuA纳米孔的N末端上，而不会破坏其膜嵌入结构和成孔特征。不同的蛋白质分析物在尺寸、电荷和结构复杂性方面都有很大变化。这些分析物产生独特的电特征，这取决于它们的身份和数量以及纳米孔识别元件-分析物组合。 这项研究采用了类似的策略，将纳米孔传感器开发为单个多肽链蛋白质，并在单分子水平上重组进入脂双层（如下图）。因此，本文中提供的所有数据都是以单分子精度确定的。结果显示通过只改变结合界面，可以获得不同的纳米孔传感器，并用于检测特定的蛋白质。该策略保持了传感器的结构、高灵敏度和特异性，同时具有对大量蛋白质分析物的通用性。
纳米孔传感器的设计。 图片来源：Nature communications FN3SUMO-tFuA纳米孔传感器 实时无标记检测hSUMO1 使用标准接头（GGS）2将单体FN3SUMO（hSUMO1识别元件）连接到tFUA的N末端。纳摩尔浓度级别下hSUMO1的存在在Oon开放亚态和Ooff关闭亚态之间产生频繁的电流阻断（下图a）。他们的归一化电流幅度A/I0为（91.5 ± 0.7）%。阴性对照测量结果表明，hSUMO1没有产生任何显著的电流阻断，即未与纳米孔产生非特异性相互作用。 研究团队对释放hSUMO1和捕获hSUMO1的持续时间进行了详细的统计分析，可计算出hSUMO1-FN3SUMO复合物的结合速率常数Kon，解离速率常数Koff，以及解离常数Kd。
hSUMO1的实时无标记检测。 图片来源：Nature communications Mb4-tFuA纳米孔传感器 检测染色质相关蛋白枢纽（WDR5） 采用了相同的方法和实验条件，使用功能重建的Mb4-tFuA传感器检测WDR5。当以纳摩尔浓度添加时，WDR5在Oon开放亚态和Ooff部分关闭亚态之间产生频繁的电流阻断（下图a），归一化电流幅度为（14 ± 1） %。同样，阴性对照测量结果表明，WDR5未与纳米孔产生非特异性相互作用，特定的WDR5-Mb4相互作用导至WDR5诱导的电流阻断。 结果表明，WDR5捕获事件的频率与WDR5浓度[WDR5]成比例，而其持续时间与WDR5浓度无关。同样可计算出WDR5-Mb4复合物的结合速率常数Kon，解离速率常数Koff，以及解离常数Kd。
WDR5的实时无标记检测。 图片来源：Nature communications Adnectin1-tFuA纳米孔传感器检测EGFR 采用了相同的方法和实验条件，使用功能重建的Adnectin1-tFuA传感器检测EGFR。在+20mV的较低跨膜电位下，显示出相对安静的电流噪音（下图a）。有趣的是，当EGFR被添加时，在宽的时间范围内观察到可逆的电流阻断，并且具有不同的电流幅度。单个EGFR捕获事件的电流振幅存在双峰分布（下图b）。例如，40 nM EGFR时，两个峰的标准化电流阻断为（65.0 ± 2.1）%和（86.1 ± 1.6）%，概率为0.72 ± 0.02和0.28 ±0.02。此外，这些峰的相对位置和概率与EGFR浓度[EGFR]无关。这一结果表明EGFR与Adnectn1结合可能有两种不同机制，这两种机制与EGFR捕获事件的标准化电流幅度的程度及其持续时间相关。
EGFR表现出双峰蛋白识别。 图片来源：Nature communications 生物流体中蛋白质生物标志物的单分子检测 在5%（v/v）胎牛血清（FBS）存在的情况下对EGFR传感器进行了测试，可溶性EGFR在生理条件下血清阈值为45 ng/ml（约112 nM）。5%FBS使电信号存在毫秒范围内的短暂电流噪声（下图c）。FBS对koff-1和koff-2没有统计学上的显著影响，但对kon-1和kon-2有相同数量级的微小变化。EGFR诱导的电流阻断的平均持续时间为τoff-2 = 0.93 ± 0.14 s，比FBS引起的持续事件长得多。最终研究团队确定了样品中[EGFR]浓度约为22.2nM，接近20nM的实际浓度。
生物流体中蛋白质生物标志物的单分子检测。 图片来源：Nature communications 此纳米孔传感器的优势 及其在纳米生物技术中的应用 在这项研究中，研究团队使用三个纳米孔传感器对三种分析物的单分子蛋白质检测进行了详细的特征分析，探测了每种分析物的不同单分子动力学特征。这三个传感器共享模块化结构，但因其结合表面不同而不同。这种方法大大扩展了这些传感元件在蛋白质生物标志物中的应用。使用抗体模拟蛋白的主要好处包括与不同表位的强结合亲和力、直接的表达和纯化程序以及高热力学稳定性。 值得注意的是，此方法有可能在具有挑战性的生物流体中检测和表征功能不同的特异性结合事件亚群。这是集成中现有技术所缺乏的一个显著优势，如BLI、表面等离子体共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）和ELISA。此外，可以进一步开发用于同时鉴定两种或多种具有不同结合亲和力和特异性的靶蛋白，不需要任何额外的外源标签的情况下探索蛋白质识别事件的复杂性和异质性。随着进一步的发展，这些传感器可以与高通量技术集成，用于生物医学诊断中的生物标志物分析。 |
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