《Nature communications》：CRISPR应用级多重核酸检测技术

此外，提供多路检测越来越重要，在多路检测中，通用的底层分子机制可以同时监测多个目标序列。到目前为止，基于CRISPR的多路复用能力一直是一个挑战。如果基于CRISPR的核酸传感技术能够实现多路复用，它将能够提高疾病监测能力，并增加传感器读出可能性（例如，比色法、血糖测定法、荧光法）的灵活性。

近日，一组来自加拿大和美国的研究团队在杂志Nature communications上发表了一篇题为“CRISPR-induced DNA reorganization for multiplexed nucleic acid detection”的文章。研究团队报道了FACT，一种基于CRISPR的核酸条形码技术，与Cas12a和Cas13a兼容，能够基于任何序列的顺式和反式切割进行诊断输出。此外，通过FACT和RePAIR（一种基于CRISPR的报告系统）结合起来，创建FACTOR，它具有多种基于蛋白质的读出能力，能够轻松交换荧光、比色和电化学信号。FACTOR显示出对DNA靶标的特异性敏感性，以及一锅复用的潜力。此外，通过反式切割激活，FACT可以很容易地连接到已建立的CRISPR诊断平台。最后，与DWV（变形翼病毒）和IAPV（以色列急性麻痹病毒）的RT-qPCR相比，FACTOR可以分别检测蜜蜂中农业上重要的病毒感染，准确率为94.7%。

研究团队开发了一种不含PAM的核酸扩增策略，该策略可以调节CRISPR读出系统。首先设计了条形码引物。靶特异性正向引物（P1）编码T7启动子，以使用T7 RNA聚合酶实现下游转录，而靶特异性反向引物（P2）编码crRNA序列（间隔区和直接重复序列）（下图a）。在HDA（用于DNA扩增）或RT-HDA（用于RNA扩增）之后，生成包含无PAM靶序列和特异性crRNA条形码的复合DNA（DNAcrRNA）。下游转录产生编码crRNA的RNA，将其切割并加载到FnCas12a中。这种核蛋白复合物可以引导报告基因dsDNA的序列特异性切割，导至荧光增加。

研究团队还开发了一种基于CRISPR的报告系统，称为RePAIR（可重编程PAIRing），该系统使用CRISPR介导的DNA重组来激活沉默的基因回路并作为解码机制，通过将无细胞蛋白质表达系统（CFS）输出连接到传感机制来扩展CRISPR扩增子功能。

为了扩大输出能力，研究团队设计了四种构建体、三种荧光蛋白和一种能够进行电化学检测的酶。对于所有荧光蛋白，在开始CFS反应的1h以内 成功检测到报告基因的信号（下图e）。对于电化学输出，研究团队为tre37A海藻糖基因设计了一个RePAIR系统。这种酶将一个海藻糖分子转化为两个葡萄糖分子。在tre37A报告基因产生正确DNA重组后，产生葡萄糖并在血糖仪上检测（图f）。总之，这些结果显示了RePAIR介导的DNA重组可适应几乎任何序列，本文使用LacZα、BFP、GFP、RFP和海藻糖的报告蛋白的三种不同输出机制（比色、荧光和电化学）进行了证明。

接下来研究团队测试了RePAIR是否与one-pot、多路DNA重组兼容，用于并行输出检测。建立单一混合反应，包含三种截短的荧光报告子（RFP、BFP和GFP），以及所有反应的供体近端链和酶（Cas12a和连接酶）。将合成DNAcrRNA单独或组合添加到混合物中以介导序列特异性RePAIR，孵育1小时，然后添加到CFS中以使蛋白质表达。孵育2小时后，在添加相关DNAcrRNA的每个相应通道中检测到特异性荧光信号，证明了基于一锅RePAIR的多路复用的高特异性和能力（下图a）。

在确定功能化的条形码扩增产物可以直接用于顺式切割输出并介导RePAIR作为核酸传感的输出后，接下来检查了条形码扩增子是否也可以与基于反式切割的CRISPR诊断连接。结果显示，无论是在Cas12a系统或是Cas13a系统，附带切割（Collateral Cleavage）可为FACT条形码核酸提供合适的读出，荧光信号在短时间内迅速增加（如下图）。

最后，研究团队试图评估FACTOR在农业使用案例中用于传染病检测的潜力，重点研究了两种关键的蜜蜂病毒：变形翼病毒（DWV）和以色列急性麻痹病毒（IAPV）（下图a）。使用从蜂蛹中扩增的病毒中提取的RNA和从感染的整只蜜蜂中提取的RNA，并将FACTOR的性能与RT-qPCR（当前的诊断金标准）进行了比较。FACTOR在DWV测试中成功诊断了19只蜜蜂中的18只，其中一只假阴性（图d），在IAPV测试中成功诊断了19只蜜蜂中的18只，其中一只IAPV因子为假阴性（图e）。FACTOR结果显示DWV和IAPV诊断的准确性为94.7%。

FACT是一种基于CRISPR的核酸追踪系统，该系统无需靶核酸中存在PAM序列。通过用crRNA序列对感兴趣的核酸进行条形码编码，可以选择诊断靶点内的任何序列，这将使基于CRISPR的诊断领域进一步扩展。该系统的灵活性还允许用户选择最适合他们需求的CRISPR酶（Cas12a或Cas13a）以及靶位点，只需重新编程具有适当特征的crRNA序列。RePAIR可被视为一种全局转换器，将CRISPR活性与广泛的基于基因回路的输出联系起来，用于便携式诊断。RePAIR可以使用单个CRISPR酶实现one-pot、多重的基因重组事件。FACTOR在蜜蜂诊断中的应用中，FACTOR可以提供与RT-qPCR相当的特异性和准确性。

尽管研究团队展示了该技术的一系列强大的性能，但这些CRISPR介导的调控应用仍处于概念验证阶段。例如，尽管组合方法显著增加了基于CRISPR的诊断的输出多样性，并解决了对特定靶序列中PAM位点的需求，但它也有可能限制其他CRISPR诊断工具可用的单核苷酸分辨率。然而，经过一些优化，可能会恢复单核苷酸分辨率。为了实现护理点部署，靶扩增或CFS可以通过缓冲液优化缩短时间，或减少所需步骤数量。

更广泛地说，FACT作为连接器，将序列输入转换为分子信号（切割、RNA、蛋白质）的能力提供了工程生物学的杠杆。这项工作将融入不断增长的CRISPR技术和平台工具箱，以促进低成本和分散的医疗保健。