在过去的十年里，已经开发了许多CTC捕获技术。要么利用CTC的形态特征，要么依赖基于免疫亲和性进行富集和分离。研究团队开发了一种基于尺寸的富集技术，使用具有特定孔径的膜微滤装置从全血和其他生物流体中分离CTC和CAFs 。利用CTC和CAFs的尺寸特征（比绝大多数正常血细胞大），孔隙允许较小的血细胞被过滤，同时捕获较大的CTC和CAFs以及一些较大尺寸的单核细胞谱系。这种方法有两个技术挑战。第一个挑战是，微过滤器膜是柔性的，在显微镜成像过程中呈现出广泛变化的焦平面，使得很难收集所有细胞都聚焦的全滤光片扫描。其次，在微过滤器上检测CTC和CAF目前是一个手动过程，分析费力、低效且主观。 近日，一组来自于美国的研究团队在杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Automatic detection of circulating tumor cells and cancer associated fibroblasts using deep learning”的 文章。在这项研究中，研究团队解决了上述两个挑战，并提出了一个全面的方案来自动检测和分析微过滤器设备捕获的肿瘤细胞和CAF。并利用培养的癌症细胞（模拟CTC，mCTC）模型系统模拟临床样本的处理过程。首先，研究团队开发了一种硬件成像解决方案，可以在柔性过滤器膜上收集高质量、均匀聚焦的图像。其次，使用这些高质量的对焦图像进行深度学习模型训练，并随后使用DL对新样本进行分析。
图片来源：Scientific reports 主要内容 总体设计 通过一种基于尺寸的富集技术，使用具有特定孔径的膜微滤装置从全血和其他生物流体中分离CTC和CAFs，捕获较大的CTC和CAFs以及一些较大尺寸的单核细胞谱系。后续分析工作的总体方法由下图所示的三个阶段组成： （a）定制的显微镜系统的自动聚焦和轴向扫描设计，以确保可以获取位于不同焦平面的所有细胞的信息。 （b）一种优化的数据预处理流水线，用于将原始多通道多切片图像合成为每个样本的单个全聚焦（AIF）RGB图像。 （c） 这些AIF图像的集合，由人类专家进行注释，随后用于训练基于深度学习的mCTC和CAF检测系统。经过训练的系统可以用于自动化新样本的分析。
总体设计示意图。图片来源：Scientific reports 具有更好自动对焦能力的玻片扫描仪 研究团队用落射荧光显微镜的定制扫描策略来模拟手动聚焦过程。 首先，在宽z范围上执行具有大步长的粗略扫描。然后，使用每个z位置处的图像来计算焦点测量（F-metric），并进行高斯函数拟合，找出最佳焦点z位置。以之为中心，执行具有精细轴向扫描以捕获整个3D信息。通过精细扫描，位于不同焦平面的细胞可以在之后进行数字重访或合成为单个2D AIF图像。可以通过横向扫描，将此策略应用于大样本的成像。最佳z焦点估计只需要针对每个横向位置运行一次，然后应用于所有荧光通道。
扫描过程中的自动对焦原理。图片来源：Scientific reports 数据预处理，用于生成全聚焦全视野图像 对于每个微过滤器载玻片，可以通过上述过程获得了多通道横向扫描的z-stack图像数据。最终目标是得到单张AIF RGB全视野图像，以便后续DL模型能够有效地处理该图像，而不会出现与散焦相关的不准确性。 数据流从原始测量开始，以多通道全聚焦整张幻灯片图像结束。预处理由三种算法组成。 全聚焦压缩原理。每个x–y位置的Z-stack被分割成更小的小块，并通过焦点测量选择最佳聚焦的Z小块。最后，z小块被融合到一个全聚焦的x–y图片中。 配准和缝合原理。由于扫描仪横向移动坐标和相机帧坐标之间的倾斜，相邻的x–y瓦片之间存在重叠。亚像素图像配准算法依赖于重叠区域来找到两个相邻x–y图片之间的亚像素偏移。以左上角（x1，y1）作为最终马赛克的锚点，通过基于距离变换的混合，将所有其他x–y小片平移并缝合到该小片上。
图片预处理流程。图片来源：Scientific reports 一种用于检测mCTC和CAFs的 集成深度学习方法 通过深度学习进行细胞检测。 （a） 训练流程。开发了一种基于病理学家筛选流程和图像处理算法的传统计算机视觉（CV）方法来粗略检测感兴趣的细胞。通过匹配注释点和分割区域，对两种方法的结果进行了交叉验证。使用训练图像及其相应的带有类标签的边界框来训练通用的深度学习模型。 （b） 测试流程。两位经验丰富的病理学家通过用边界框注释感兴趣的细胞来筛选测试图像及进行双重检查，结果被视为基本事实。同时，通过传统的CV方法对测试图像生成带有标签的预测框。最后，使用细胞检测模型直接生成预测的边界框。将后两种方法的结果与实际情况进行比较，结果显示深度学习模型优于传统的CV方法。
通过深度学习进行细胞检测。图片来源：Scientific reports 集成深度学习模型优于传统的计算机视觉方法 下图显示了ground truth、DL模型和传统CV方法检测mCTC的例子。传统的CV方法由于两个主要原因错过了大量的mCTC。CV似乎难以分割细胞团，错误地将几个mCTC预测为一个。其次，被沉淀物包围的mCTC似乎更有可能被消除。 DL模型在检测精度上超过了传统的计算机视觉（CV）方法。mCTC检测模型实现了精确率94%（± 0.2%），召回率为96%（± 0.2%），CAF检测模型的精确率达到93%（± 1.7%），召回率为84%（± 3.1%）。相比之下，传统CV方法可以检测mCTC，精确率为92%（± 0.2%），召回率为78%（± 0.3%）和精确率为58%的CAFs（± 3.9%），召回率为56%（± 3.5%)。
mCTC检测的评估。图片来源：Scientific reports 总结与讨论 研究团队的微滤技术提供了一个强大的平台，可以从癌症患者的外周血中捕获和富集CTC和其他稀有细胞。对这些事件的评估为以微创方式进行液体活检诊断提供了机会。为此，研究团队在这里提出了硬件和基于深度学习的分析解决方案相结合，可以显著促进基于细胞的液体活检癌症诊断实践。一种基于深度学习的方法来自动识别用于模拟CTC（mCTC）和CAFs，结果显示深度学习方法对mCTC和CAFs的自动识别，明显优于传统的计算机视觉方法。 实验中，CAFs检测的AUC值略低于mCTC检测，这可能是由于在这组实验中使用较低数量级的CAF实例。预计通过增加培训实例的数量，将看到AUC的提高。或者可以使用现有的模型，将其作为筛选工具来辅助手动分析。选择召回率高的操作点虽然将导至CAF的高识别率和高误报率，但是人工操作员可以排除误报率。 基于DL技术的全自动CTC和CAF检测系统有助于将人类劳动力从繁琐的细胞识别中解放出来，并消除过程中的人类主观性。我们预计，这种系统可能会在临床研究中得到应用，并最终应用于临床癌症管理。 |
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