【综述】叶酸检测标准化现状及挑战

三、检测方法现状和研究进展

目前临床上主要通过叶酸结合蛋白（folate-binding protein，FBP）法检测总叶酸（total folate，tFOL），该方法特异性较差，不同检测系统间存在较大差异。同位素稀释液相色谱串联质谱（isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry，ID-LC-MS/MS）法更为灵敏和特异，但该方法在检测FA时，不同实验室结果差异较大。鉴于叶酸在临床应用中的重要性，美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）、美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）等组织通过建立参考方法、研制参考物质，推进叶酸检测标准化，以促进结果的准确可比。

目前，叶酸的检测方法主要有微生物检测法（microbiological assay，MA）、FBP检测法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法和ID-LC-MS/MS法。这些方法均可对血清/血浆和红细胞叶酸进行检测。其中FBP法检测成本低，为临床样本提供快速的自动化分析，而且对实验室人员要求不高，是目前临床实验室最常用的叶酸检测方法。

（一）微生物检测法

MA法是最早应用于叶酸检测的方法，可以检测所有具有生物活性的叶酸代谢物，但不能检测缺乏生物活性的降解产物^［8］。MA法检测叶酸通常使用鼠李糖乳杆菌和粪链球菌等叶酸依赖性细菌，不同的微生物需要使用不同的校准品^［9］。MA法灵敏度高，但精密度较差。

随着耐氯霉素鼠李糖乳杆菌、96孔微孔板，以及冻干保护剂的引入，MA法开始广泛应用于营养状况调查中叶酸的检测^［10］。

（二）叶酸结合蛋白法

由于MA法精密度差、耗时费力、通量有限，FBP检测法在20世纪70年代开始取代MA法，被广泛用于临床实验室中^［2］。英国国家室间质量评价服务（United Kingdom National External Quality Assessment Service，UK NEQAS）报告显示，Roche Cobas（美国），Abbott Architect（美国），Siemens Centaur（德国），和Beckman Dxl（美国）是检测血清/血浆叶酸的最常用的平台^［11］。国家卫生健康委临床检验中心最新的室间质量评价（external quality assessment， EQA）数据显示，目前我国临床实验室叶酸检测也主要采用这四个平台。除此之外，国产品牌迈瑞在国内的使用也较为广泛。

自动化FBP方法精密度高，方法内变异系数（coefficient of variation，CV）约为10%，总CV低于10%^{［11, 12］}。然而，FBP特异性不佳，对不同叶酸代谢物具有不同的结合亲和力，这种差异可能会导至检测结果偏低^［13］。此外，在营养补充的背景下，FBP法分析范围过窄（2.0~20 ng/ml），而稀释样本检测时，又存在明显基质效应。与MA法相同，氨基蝶呤、亚叶酸和甲氨蝶呤结构与叶酸相似，可与叶酸发生交叉反应。

目前叶酸检测试剂盒多使用酶联免疫反应体系，反应时间长且线性范围窄。2019年卢菲等^［14］采用生物素-亲和素反应体系，开发了一种叶酸的快速检测试剂盒，线性范围可达到1.5~50 ng/ml，其他性能指标也都处于国内领先水平，有望取代国外同类型试剂盒。

（三）高效液相色谱法

HPLC法使包括多谷氨酸叶酸在内的单种叶酸代谢物定量成为可能。该方法常使用紫外检测器，但紫外检测灵敏度较低。相比之下，荧光检测器灵敏度更高，但FA缺乏荧光活性，需要在柱后氧化为荧光衍生物后，才能使用该方法定量^［15］。此外，HPLC也可联合微生物检测或电化学检测^{［16, 17］}。HPLC法现在仍被用于检测某些叶酸代谢物，但已被更灵敏、更快速的ID-LC-MS/MS检测法所取代。

（四）同位素稀释液相色谱串联质谱法

ID-LC-MS/MS法使用稳定同位素标记的内标，可以补偿前处理和检测过程中的损失，样本处理方法选择性高、检测特异性高、灵敏度和精密度良好，可完全排除氨基蝶呤、亚叶酸和甲氨蝶呤等结构类似物的干扰，因此被认为是基于HPLC方法的首选检测系统^［18］。根据叶酸在溶液中的电荷状态，可以用反相吸附剂和离子交换吸附剂将叶酸与基质成分分离。反相吸附剂使用更频繁，因为血清样本通常用1%抗坏血酸溶液稀释，这促进了α-和γ-谷氨酸羧基质子化。反相吸附剂中苯基和C18吸附剂是最常用的，通常洗脱液使用一小部分有机溶剂，甲醇或乙腈，酸化以适应流动相。此外，洗脱液和流动相的酸性pH都可能影响叶酸的稳定性。同时，在使用LC-MS/MS时，必须考虑用于洗脱的高浓度盐可能会干扰电离。叶酸属于极性化合物，目前大多数质谱方法使用反相色谱柱进行分析，可达到较好的保留和分离效果。相对于反相色谱柱，亲水作用色谱柱使用较少，可能是因为流动相中的高浓度盐会干扰电离。表2例举了部分国内外已建立的ID-LC-MS/MS法。

由于仪器设备和方法开发人员的水平不同，实验室能检测到的叶酸代谢物形式各不相同。而MA法和FBP法只能对tFOL定量，无法区分单种叶酸代谢物，因此质谱法与MA法或FBP法进行比较时，需要定义质谱法tFOL的组成。根据目前实验室检测能力，质谱法tFOL一般包括FA、5MeTHF和5FoTHF。此外，使用质谱法检测时还应考虑5MeTHF的氧化产物氧化产物4α-羟基-5-甲基四氢叶酸的吡嗪-s-三嗪衍生物（pyrazino-s-triazine derivative of 4α-hydroxy-5-methylTHF，MeFox）对结果的干扰。MeFox可以用于考察样本在储存或处理过程中可能受到的氧化应激程度，但是MeFox与其同分异构体5FoTHF在色谱和质谱分离过程中表现相似，很可能存在共洗脱和错误识别，如果不进行适当的分离，则会使tFOL结果产生偏差^［26］。

由于液质联用仪器价格昂贵，目前ID-LC-MS/MS法在我国临床实验室很少应用。部分第三方检验所建立了ID-LC-MS/MS方法，以提供相应的检测服务，但是这些方法能够准确定量的叶酸代谢物有限^［27］。此外，ID-LC-MS/MS方法也被用于我国强化食品中叶酸含量的检测^［28］。

（五）检测现状

在开发参考测量程序（参考方法）前，大多数检测平台只能溯源至厂商内部标准品。在这一阶段，血清和红细胞叶酸检测系统间检测结果差异较大^{［12， 29］}。2011年，Blackmore等^［30］表示参与UK NEQAS Haematinics EQA计划的所有实验室tFOL均值与CDC ID-LC-MS/MS参考方法靶值之间有良好的一致性，但不同的方法与参考方法的一致性不同。其中，Abbott Architect与参考方法的一致性最佳，这可能是因为当时只有Abbott公司报告可溯源至WHO IS 03/178^［30］。2015年，CDC开展了2次国际Round Robin研究^［31］，首次对血清叶酸LC-MS/MS方法可比性、精密度和准确度进行研究。研究发现，实验室检测5MeTHF的精密度和可比性和良好，而检测FA的CV较高，且检测结果差异较大^［31］。2016年，挪威临床化学EQA机构Kristensen等^［32］表示不同厂商的tFOL结果差异在理想偏差的范围内，并表示这可能是因为叶酸生物学变异很大，可接受标准范围相对较宽^［32］。2017年UK NEQAS Haematinics计划报告红细胞叶酸的检测结果存在显著差异，方法内CV为12%~32%，总CV约为40%^［11］。为了满足欧盟体外诊断器械指令98/79/EC要求，如今大多数tFOL检测系统已经重新校准溯源至IS 03/178^{［33, 34］}。2019年，Braga等^［33］研究了使用IS 03/178作为商业检测系统的通用校准品是否能够改善方法间的一致性，结果发现大多数检测系统检测结果偏高，仍然存在较大方法间CV。

国家卫生健康委临床检验中心内分泌EQA计划结果显示，2019年全国共有1 100余家实验室参加叶酸EQA计划。迈瑞组实验室间CV为11.48%~20.22%，Abbott、Roche、Siemens Centaur、新产业、Beckman DxI/DxC各组实验室间CV较小，分别为4.6%~9.6%、5.5%~10.1%、2.32%~10.86%、4%~7.26%、4.76%~7.52%。此外Siemens Centaur组和迈瑞组检测结果存在明显的正偏倚，这可能是因为校准品存在差异。贾永娟等^［35］研究发现，ID-LC-MS/MS法和FBP法叶酸检测结果存在差异，并且差异与浓度相关。

综上所述，目前血清叶酸检测精密度较好，但方法间可比性不佳。使用IS 03/178校准后，不同检测系统间结果仍存在差异。为了进一步改善方法间的一致性，厂商应该在校准品的量值溯源中投入更多精力。

四、标准化现状和进展

（一）参考测量程序（参考方法）

国际检验医学溯源联合委员会数据库已将CDC的人血清叶酸ID-LC-MS/MS法（可准确定量5MeTHF、FA和5FoTHF）^［36］和NIST的血清叶酸ID-LC-MS/MS（可准确定量5MeTHF和FA）纳入参考方法列表^{［37, 38］}。这两种方法均使用5个¹³C标记的内标定量，使用苯基或C₁₈固相萃取小柱提取叶酸，使用氰基或C₈分析柱分离，然后通过ESI⁺LC-MS/MS进行检测。CDC参考方法对5MeTHF、FA和5FoTHF的检测限分别为0.13、0.07和0.05 nmol/L，批间不精密度分别为<7%，<10%（>2.0 nmol/L），<10%（>0.5 nmol/L）^［36］。随着ID-LC-MS/MS定量技术的发展，CDC开发了一种常规ID-LC-MS/MS方法，该方法能够定量5MeTHF、FA、5FoTHF、THF、5，10-次甲基四氢叶酸以及MeFox，所需样本体积减少到150 μl。该方法已用于为最新的血清标准物质SRM 3949定值^［22］。

（二）参考物质

英国国家生物标准品及质量检定所（National Institute for Biological Standards and Controls，NIBSC）1996年发布了第一个全血叶酸国际标准物质IS 95/528。当时尚无参考方法，因此通过多种MA法和FBP法为其定值（tFOL 13.0 ng/ml）。使用IS 95/528取代实验室的内部标准品和校准品对检测方法进行校准，可显著降低实验室间变异^［39］。

随后NIBSC研发了血清叶酸的第一个IS 03/178（2007年起可用）。IS 03/178通过7个国家24个实验室（其中包括CDC参考方法ID-LC-MS/MS）检测，tFOL浓度为5.33 ng/ml（tFOL值由5MeTHF，5FoTHF和FA组成）。Braga等^［33］发现IS 03/178在所有被评估的检测系统间表现出良好的互通性。Thorpe等^［40］表示，使用03/178对血清叶酸标准化，可使实验室间差异从约17%~20%减小到6%~9%。需要注意的是，IS 03/178中FA浓度很低，接近定量限，且正离子模式下FA检测灵敏度相对较差，这可能会导至不同质谱方法检测FA结果差异较大^［40］。

2006年，NIST发布了血清叶酸的第一个标准参考物质SRM 1955（二级参考物质），使用CDC参考方法和NIST开发的多个参考方法为其定值。SRM 1955有3个浓度水平，提供了5MeTHF认定值，FA参考值以及5FoTHF和tFOL提示值^［41］。Ihara等^［42］的研究结果显示SRM 1955在Access、Advia Centaur和Elecsys系统中具有良好的互通性。

目前，NIST已使用新制备的SRM 3949（二级参考物质）替代SRM 1955。相比SRM 1955，SRM 3949有几处改进：包括部分补充了FA的捐献者，能更好地反映当今进行叶酸强化的人群中观察到的水平；叶酸浓度范围更宽；添加抗坏血酸，稳定性增加；为次要叶酸代谢物赋值；改进定值方法。SRM 3949有3个浓度水平，L2浓度水平的tFOL浓度（24.71 ng/ml）高于大多数检测系统的测量上限，L3浓度水平的tFOL浓度（18.45 ng/ml）也相对较高。SRM 3949提供了5MeTHF和FA的认定值，以及THF、5FoTHF、MeFox、tFOL的非认定值（即参考值）。tFOL参考值由CDC ID-LC-MS/MS提供。Braga等^［33］将4个FBP方法进行两两比较，结果表明SRM 3949 L1浓度水平（tFOL 7.5 ng/ml）在评估系统间具有互通性，可以用作正确度质控品，但是需要谨慎解释Advia Centau的检测结果。

2016年NIST发布了首个基于血浆的参考物质SRM 1950，用来验证血浆中代谢物的检测方法。NIST并未专门针对叶酸开发此SRM，但提供了5MeTHF的认定值和FA的参考值，两者均只有一个浓度水平。目前尚未发现文献报道SRM 1950互通性信息。

从目前的方法学比对研究结果来看，为了提高方法的准确度，除了5MeTHF的认定值外，参考物质还应具有其他叶酸代谢物和tFOL的认定值^［31］。

（三）叶酸检测程序校准的溯源链

按照ISO 17511文件对校准溯源性的规定，可以绘制出血清叶酸检测的溯源链（图2）。目前国际上尚未有经过认证的叶酸纯度参考物质，因此叶酸测量现在可以追溯到以血清为基质的二级参考物质^［43］。溯源的每个步骤都有相关的不确定度，Ferraro等^［44］使用基于分析性能对临床结果影响的模拟模型，定义了血清tFOL的分析质量指标。根据这一模型，Braga等^［33］推导出在临床样本浓度（平均tFOL浓度4.0 ng/ml）下，血清tFOL测量理想的不确定度目标是5.0%。

图2 血清叶酸检测程序校准的溯源链

（四）叶酸检测标准化面临的困难

FBP对不同的叶酸代谢物亲和力不同，而pH的微小偏差就会影响FBP的亲和力。此外，FBP在tFOL浓度不同的样本中对各种叶酸代谢物的回收率也有不同^［2］，如果不优化检测条件，这种亲和力差异将会影响结果准确度^［13］。FBP方法与ID-LC-MS/MS方法的选择性不同，难以利用现有的参考物质进行真实的正确度评价。

厂商对校准品不确定度制定的可接受标准较大也是标准化面临的阻碍。因为过大的不确定度可能会导至检测结果与参考物质的靶值偏倚过大。因此厂商应该遵守其内部操作流程，将参考物质的正确度转移到商业校准品后，再转移到临床样本的检测中^［33］。但是FBP方法重新校准后，检测结果会发生变化，同时也会改变与现有参考区间以及医学决定水平之间的关系，导至无法使用当前的临床决策标准^［2］。因此重新校准方法的同时，需要建立方法特异的cut-off值^［33］。

（五）我国叶酸检测的标准化现状

与国际标准化进程相比，我国叶酸标准化工作起步较晚，但目前已经开始着手叶酸检测的标准化工作。中国计量科学研究院于2013年和2016年相继发布了叶酸纯度标准物质GBW（E）100265（国家二级标准物质）和GBW10126（国家一级标准物质），均采用质量平衡法与定量核磁共振法对标准物质进行定量检测。2018年，北京市医疗器械检验所发布了冷冻人血清中叶酸、胰岛素标准物质GBW（E）090925，填补了我国叶酸检测血清标准物质的空白，有助于改善我国叶酸检测结果的可比性，推进检验结果互认，减少患者的重复检查。GBW（E）090925采用实验室协作方式进行定值（化学发光免疫分析法）。其中，叶酸（8.9±0.8 ng/ml）溯源到WHO 03/178。2018年我国医药行业标准“叶酸检测试剂盒（化学发光免疫分析法）”（YYT1583—2018）和卫生行业标准“人群叶酸缺乏筛查方法”（WS/T 600—2018）批准实行。目前，我国国家卫生健康委临床检验中心已经开展了多年叶酸检测的EQA计划，并已经在2020年开展了叶酸检测的正确度验证计划，这一举措将有力地推动国内叶酸检测标准化工作的进行。

五、总结和展望

准确定量血液叶酸含量对诊断叶酸缺乏具有重要意义。然而，因为叶酸稳定性较差，代谢物种类繁多，结构和功能各异，目前叶酸检测标准化仍面临着一些挑战。为进一步推进叶酸检测标准化进程，厂商应优化FBP法检测条件，使方法特异性达到最佳，同时应该遵守内部操作流程，将患者样本测量结果溯源至参考物质；对于ID-LC-MS/MS方法，需要考虑tFOL值应该包含哪些叶酸代谢物，尽可能对多种代谢物形式进行准确定量。此外，相关机构应积极研发具有互通性的参考物质，提供其他叶酸代谢物和tFOL的认定值。我国目前尚未建立叶酸检测的参考方法，因此需要尽快建立基于ID-LC-MS/MS的参考方法，研制参考物质，建立具有溯源性的统一生物参考区间，为临床决策提供更准确有效的信息。