深度综述：CRISPR/Cas用于肿瘤治疗药物的体内递送

近日，一组来自伊朗的研究团队在杂志Cancer Gene Therapy上发表了一篇题为“Viral vectors and extracellular vesicles: innate delivery systems utilized in CRISPR/Cas-mediated cancer therapy”的综述文章。CRISPR-Cas系统可以使用各种策略（如病毒载体、细胞外囊泡（EV）、物理方法和纳米复合物）输送到哺乳动物细胞中；在文章中，研究团队回顾了关于病毒载体、细胞外囊泡（EV）这两种已被证明与人类细胞相容的天然基因递送系统的最新研究。并讨论了病毒载体和细胞外囊泡（EV）在递送CRISPR/Cas系统用于癌症治疗方面的优势和局限性。

CRISPR-Cas9系统可用于精确定位癌症特异性序列的变化。基于CRISPR/Cas的方法为利用基因治疗和免疫治疗治疗癌症提供了一条巧妙的途径。

病毒是基因传递的真正载体。哺乳动物基因治疗已通过重组和假型病毒载体实现。CRISPR/Cas递送最常用的病毒载体是腺相关病毒（AAV）、腺病毒载体（AdVs）和慢病毒载体（LV），它们正在临床试验中使用。

AAV是一种小型、无包被的单链DNA病毒，对人类没有致病性，具有相对较低的免疫原性、细胞毒性和染色体整合概率（如下图）。此外，不同类型的AAV可用于基因递送到多种细胞中，如肺、心脏、神经元和肌肉细胞，从而使其成为组织特异性应用的极好的载体。迄今为止，许多基于AAV的基因疗法已获得FDA批准，例如，在庞贝病和遗传性视网膜疾病（IRD）中，表明了AAV载体的有效性。此外，AAV对CRISPR/Cas9系统的有效递送为疾病建模铺平了道路，如神经退行性异常、肌营养不良、肝病和镰状细胞病。

尽管如此，但AAV有限的包装能力和基因组长度限制了其承载不超过5 kb，携带SpCas9蛋白等大型货物仍然是一个相当大的限制。科学家们设计了许多方法来绕过AAV包装能力有限的障碍。一种策略是使用两种不同标记的AAV共同转导细胞，一种携带sgRNA，另一种携带Cas9蛋白。然而，这种方法需要高病毒剂量和确认共转导。为了将更长的基因输送到宿主细胞中，科学家设计了一种三重AAV系统。另外，AAV也已被证明是递送新型CRISPR DNA碱基编辑工具的潜在系统。

AAV的特点，包括低免疫原性和细胞毒性，以及染色体整合的可能性很小，使其成为CRISPR/Cas系统的理想输送系统。除此之外，具有多种类型和多样的递送方法，如双AAV载体和三AAV载体，弥补了其与其他病毒载体相比的局限性，并使其成为基因递送的前沿。

AdV是一种双链DNA病毒，可以转导广泛的分裂细胞和非分裂细胞。这些载体可以携带长达37kb的基因 ，并且在转导之后，它们产生游离DNA（episomal DNA），而不是整合到基因组中，消除了CRISPR/Cas基因编辑的脱靶效应。

第三代AdV载体允许克隆高达35kb的病毒基因；因此，它们突破了递送CRISPR/Cas9系统的尺寸限制屏障，且这一代不会引发慢性免疫反应。重组AdV5已显示出在小鼠体内CRISPR/Cas9介导的人α-1-抗胰蛋白酶基因敲入的潜力，并且已证明基因表达持续超过200天。在最近的一项研究中，AdV向人类肝细胞递送CRISPR/Cas12a也表明其在人类细胞基因编辑方面的潜力。此外，AdV结构蛋白是非常可操纵的，这有利于产生具有组织特异性的AdV。

总之，最新的AdV具有巨大的包装能力，且不会引发慢性免疫反应，消除了CRISPR/Cas基因编辑的脱靶效应，加上AdV的安全性，可以大规模生产，并且生产成本效益高，这使得它们对于CRISPR/Cas的递送必不可少。AdV成为2019年冠状病毒病（新冠肺炎）mRNA疫苗的首选疫苗，这一事实验证了这些有益特征。

HIV-1衍生的LV是单链RNA（ssRNA）病毒，主要用于将所需转基因整合到分裂和非分裂细胞中（如下图）。他们的基因运送能力约为9 kb，被富含脂质的衣壳包围。LV的第三代和第四代对临床应用最为安全。

最近的一项研究使用LVs递送的CRISPR/Cas9系统敲除了小鼠体内的HIF-1α，在注射后三天，它显著降低了肿瘤组织中HIF-1α的表达，显示出有价值的抗肿瘤作用。产生融合癌基因的染色体易位在某些癌症中很常见，并且是重要的肿瘤发生因素。有研究团队使用基于LVs的CRISPR/Cas9系统诱导BCR-ABL融合基因内含子的缺失，这导至BCR反式激活域的显著缺失以及ABL DNA结合域的移码突变。不仅如此，LVs递送的CRISPR/Cas9系统的能力正在扩展到HIV-1和HBV感染的靶向治疗以及遗传缺陷疾病的治疗领域，如囊性纤维化和神经变性疾病。由于LVs会将转基因整合到宿主基因组中，并且由于其长期的基因表达，脱靶效应可能会引起关注。为了解决这一风险，开发了整合缺陷慢病毒载体（IDLV），以提供短暂的CRISPR/Cas表达。

细胞外囊泡是纳米级的非病毒递送系统，可用于各种目的，其中之一是用作靶向递送系统。EVs是由不同细胞产生的脂质包裹颗粒，其内源目的是细胞-细胞之前运输，如遗传物质和蛋白质。EVs可分为三大类：微囊泡（MV）、外泌体和凋亡小体。其中，具有30–150 nm直径的外泌体是选择性递送蛋白质和遗传成分的真正选择，包括CRISPR/Cas系统（如下图）。

外泌体因其在癌症诊断和治疗中的应用而备受关注。将所需货物装载到肿瘤衍生的外泌体中，可以促进细胞特异性方法进行癌症治疗。与单独应用药物相比，将Doxil装载入肿瘤衍生的外泌体，并将其注射到来源组织中，可以促进肿瘤抑制。外泌体在肿瘤细胞中CRISPR/Cas递送的潜力可以从其递送选择性和高效递送系统的能力推断出来。使用外泌体介导的基因递送，特别是在递送CRISPR/Cas系统的情况下，一个严重的问题是对外周和远处组织的潜在非靶向负面影响。

除了外泌体的包装能力外，将其设计成靶向递送载体也是一个基本目标。神经系统特异性的脑靶向外泌体显示出强大的治疗潜力，其他组织没有非特异性摄取。

与病毒不同，外泌体可以在大小上进行修饰。混合外泌体已被开发用于携带CRISPR/Cas系统等大型货物。混合外泌体不仅具有更大的包装能力，而且由于脂质体的正电荷，它们与带负电荷的RNA和DNA更有效地相互作用，使遗传物质更容易加载到外泌体中。

外泌体也可以用DNA适体（一种短的合成寡核苷酸）进行优化，以便将外泌体用作靶向递送系统。最近的一项研究使用外泌体表面的DNA适体，在体外和体内选择性地将CRISPR/Cas系统特异性地递送到肝癌细胞中。

有核细胞衍生EVs介导的水平基因转移的风险可以被视为EVs的一个限制，但RBC衍生EVs绕过了这一安全相关问题。可以推断靶向RBC-EV对特定癌症细胞传递CRISPR/Cas9系统的巨大潜力。

总之，EVs，尤其是肿瘤衍生EVs已被证明在CRISPR/Cas基础癌症治疗中绕过肿瘤防御机制非常有效。它们大小不同，含有不同的遗传物质，易于操作、可靠的基因传递和高安全性，使EVs成为强大的癌症治疗武器。

外泌体包裹的病毒载体(Vexosomes)是一种新的基因递送方法，它赋予病毒载体外泌体特征，如广泛的细胞嗜性、几乎无免疫原性和可大规模生产。EVs在其从细胞分泌时将病毒成分包封。

AAV/EV可以通过在其表面包含靶向肽以更选择性地递送基因。AAV/EV载体可以通过血脑屏障并有效地转导神经细胞。不同血清型的AAV，包括AAV1、AAV6和AAV9，已分别用于将转基因靶向递送至耳蜗和前庭毛细胞、神经元和少突胶质细胞。

将EVs和病毒载体的力量和潜力结合在一起，有望在基因递送领域，特别是CRISPR/Cas递送领域取得巨大的未来。

CRISPR/Cas技术提供了一种典型的基因编辑应用，但在临床癌症治疗中，它并不是主要的参与者。基于CRISPR的基因组编辑在不久的将来有望用于癌症诊断和治疗。

CRISPR-Cas9可用于精确定位癌症特异性序列的变化。例如，CRISPR/Cas9可以检测称为短串联重复序列（STR）的微卫星序列，该序列可以作为癌症标记。还开发了其他用于癌症相关突变的高精度酶核酸检测系统，称为DETECTR和SHERLOCK，分别使用Cas12a和Cas13。

除了癌症诊断之外，CRISPR还应用于临床癌症治疗。2016年，四川大学华西医院使用CRISPR/Cas9系统治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。在这项研究中，患者的T细胞经过基因改造，不表达T细胞活化抑制分子PD-1。因此，这种方法也被用于其他组织的癌症，包括膀胱、前列腺、肾脏和食道。此外，多重CRISPR-Cas9系统已用于同时敲除T细胞中的多个基因，包括T细胞受体（TCR）链和PD-1。所有这些努力都表明，CRISPR/Cas9系统是提高癌症免疫治疗水平的一大武器。

鉴于CRISPR/Cas系统可以引入人体细胞，它可能是保护我们免受致癌病毒侵害的有力工具。一些病毒能够在人类中引发癌症，例如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒（HBV和HCV）、人乳头瘤病毒（HPV）和爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV），它们分别会导至肝细胞癌（HCC）、宫颈癌症和伯基特淋巴瘤。鉴于CRISPR/Cas系统可以引入人体细胞，它可能是保护我们免受致癌病毒侵害的有力工具。

尽管CRISPR系统是最近才开发出来的，但它在癌症诊断和治疗方面已经取得了重大进展。研究人员可以使用CRISPR/Cas在体外、体内或体外抑制或诱导基因表达。尽管CRISPR面临一些挑战，但由于其在精确癌症治疗和免疫治疗方面的潜力，近年来受到了广泛关注。

尽管CRISPR在癌症诊断和治疗中的广泛应用，但仍存在局限性和需要在未来解决的问题。其中之一是CRISPR/Cas诱导的DSBs的概率，导至基因缺失。另一个问题是CRISPR/Cas系统的脱靶效应。

将CRISPR/Cas系统输送到体内或体外靶细胞有其自身的挑战。为了解决这些问题，使用了不同的递送系统，包括物理方法、病毒载体、细胞外囊泡、纳米复合物等。近年来，这两个真正的系统结合在一起，创造了一种新的载体，称为“vexosomes”。总的来说，递送系统的进步为高效的CRISPR/Cas癌症治疗带来了光明的前景。