目标生物分子的灵敏检测和定量在基础科学和应用科学的许多领域都至关重要，尤其是蛋白质，是一类重要的生物分子靶点，可以作为生物标志物来诊断和监测病理状况以及治疗的效果。因此，蛋白质传感的发展是实现更精确蛋白质分析和疾病诊断的一条有前途的途径，在精密和个性化医学的新兴领域具有巨大潜力。 与核酸分析物相比，蛋白质的检测难度更大，因为它们不能根据碱基对互补性直接扩增或靶向。为了实现特异性和敏感性，蛋白质检测分析通常在检测之前分离靶蛋白，通过亲和试剂对靶分子的表面捕获来操作，比如酶联免疫吸附试验（ELISA）。最近的一些方法改进了经典的ELISA技术，导至了数字传感格式的发展。其他传感技术，包括基于单分子和微流体的测定，已被用于蛋白质的定量和检测。这种方法虽然吞吐量较低，但有可能探测相互作用的物理参数，因此超出了简单浓度测量。ELISA以及其他基于表面的测定（例如，表面等离子体共振）共同面临的中心挑战是，由于表面的有限结合面积而限制了分析物捕获效率，因此需要使用高度优化的捕获探针，对于某些生物标记物靶标来说是不可行的。更重要的是，基于表面或基质的分析可能不适用于许多诊断感兴趣的分析物，包括外泌体。另外，传统技术通常不告知分析物性质。 近日，一组来自英国的研究团队在杂志Nature communications上发表了一篇题为“Direct digital sensing of protein biomarkers in solution”的文章。在文章中，为了解决上述挑战，研究团队在此提出了一种称为数字免疫传感器测定（DigitISA）的单分子蛋白质传感方法，该方法在游离溶液中操作，将微芯片电泳分离步骤与激光共聚焦荧光显微镜原位单分子检测相结合，允许通过单分子数字计数检测样品中存在的蛋白结合亲和试剂分子的数量，检测蛋白质靶标并在溶液中定量其丰度。此外，由于检测过程的数字性质，该分析能够对结合相互作用进行多模态表征，包括免疫化学/价态、结合化学计量、蛋白质生物标记物丰度，并提供关于探针-分析物相互作用和样品组成的进一步定量信息。
图片来源：Nature communications 工作原理及分析设计 DigitISA的设计原理基于以无表面方式结合溶液内分析物捕获和无需清洗去除未结合探针（图a）。将含有目标蛋白和荧光标记的捕获探针的样品注入微流体自由流动电泳分离芯片中，并基于电泳迁移率的差异（即分子的净电荷与其大小的比率）将蛋白结合的亲和试剂与非蛋白结合的试剂区分开来。同时将微芯片电泳分离步骤与激光共聚焦荧光显微镜原位单分子检测相结合，这允许通过单分子数字计数检测样品中存在的蛋白结合亲和试剂分子的数量。
DigitISA的工作原理及平台。 图片来源：Nature communications DigitISA平台在生物医学分析中的适用性 为了评估使用DigitISA平台进行生物分子检测和定量的可能性，研究团队使用DigitISA平台进行生物素-链霉亲和素的复合物的探索（图a）。 研究团队首先施加了150V的电场，结果显示，生物素化的DNA探针偏转几百微米，允许它们与链霉亲和素-生物素复合物区分开来。与游离生物素探针相比，链亲和素的结合降低了DNA缀合的生物素分子的电泳迁移率。且DigitISA平台以数字方式计算通过分子的数量（图c），可直接估计目标浓度。具体计算方法见文章，在这里不赘述。 研究团队还使用DigitISA平台检测IgE蛋白质分子来展示快速（即~2 s） 定量蛋白质生物标志物传感的优势。由于DigitISA的操作速度比基于ELISA的方法快两个数量级以上，因此在测定时间内发生的探针-分析物解离可忽略不计。结果显示，检测出的样品中存在的IgE浓度与IgE的起始浓度非常一致，该结果证明了此方法对定量蛋白质传感的有效性，即使对于相对较弱的结合探针也是如此。
使用DigitISA平台检测生物素-链霉亲和素复合物。 图片来源：Nature communications α-突触核蛋白淀粉样纤维的传感 研究团队接下来展示了DigitISA平台通过使用高探针浓度直接检测探针-分析物结合平衡的能力。为此研究了α-突触核蛋白原纤维与适体之间的结合，α-突触核蛋白聚集体的检测被提出作为早期检测帕金森病和其他突触核蛋白疾病的手段。适体与α-突触核蛋白原纤维的结合降低了原纤维的电泳迁移率，从而使适配体结合的原纤维与过量提供的未结合探针有效分离（图b），在较低电泳迁移率下识别了原纤维-适体复合物，且可以使用公式计算出适体-α-突触核蛋白原纤维复合物的浓度以及未结合适体浓度。 由于在测定时间内探针结合强度弱，探针-适体复合物的快速解离将使结合靶标的浓度大大低于传统的检测检测限。这些因素说明了DigitISA平台可以用于检测弱生物分子结合相互作用，这是一个传统多步骤方法难以实现的特征。
在高适配体探针浓度下检测α-突触核蛋白原纤维。 图片来源：Nature communications α-突触核蛋白低聚物的无标记检测与分析 DigitISA技术还可以应用于α-突触核蛋白低聚物的检测。研究团队使用了低聚物选择性荧光标记适配体探针，它对α-突触核蛋白低聚物有较好的亲和力（Kd = 150–200 nM），但不结合α-突触核蛋白单体。结果显示，寡聚体结合的适体（图b，蓝线）与过量适配体探针（橙色线）分离，使得在DigitISA实验中能够对其进行单分子计数。 除了定量野生型寡聚物的浓度外，通过提供适配体-寡聚物结合价的估计，进一步分析还可以获得寡聚物免疫化学的信息。寡聚体-适体复合物通过共焦点的荧光爆发比未结合的适体更强烈（图d，e），这一观察提示多价寡聚体-适配体结合。估计每个低聚物结合的适配体的近似平均值为1.38个，且平均每个低聚物具有2.5–3.0个适配体结合位点。 这个发现证明了此平台能够在单个测量中实现数量-浓度定量以及寡聚物免疫化学和化学计量的表征，这是使用常规免疫化学技术（如ELISA）是不可能的。
α-突触核蛋白低聚物的传感和免疫化学分析。 图片来源：Nature communications 外泌体的标记蛋白检测和定量 为了证明DigitISA技术在复杂的多组分系统中感知和量化蛋白质生物标志物的能力，研究团队开始探测外泌体表面存在的生物标志物蛋白CD63（图a）。结果显示在即较低的迁移率下2300μm附近的通道坐标处检测到适体-外泌体复合物 ，且对这些低迁移率位置的检查（图d）显示了高强度的荧光爆发事件。通过计算可得知样品中CD63阳性外泌体的浓度，且每个外泌体结合的适体的平均中值数量在5.8–7.1的范围内。
外泌体生物标志物的DigitISA免疫检测。 图片来源：Nature communications 生物分子凝聚体的传感 为了进一步展示DigitISA平台的功能，研究团队探索了检测通过相分离形成的生物分子凝聚体（FUS）的可能性。为了将DigitISA技术用于FUS检测使用了荧光标记的适体，该适体已知对FUS蛋白具有中等亲和力。结果显示，由于其迁移率降低，FUS-适体在较高通道位置（即较小的偏转距离）洗脱（图c）。结果还表明，FUS-适体峰的信号不仅包括代表单体FUS的主体信号，还包括具有高强度的爆发信号的FUS凝聚体。利用这些数据，可以提取适配体对FUS单体和FUS凝聚体的亲和力，以及凝聚体浓度、适配体在凝聚体中的分配比例、凝聚体中的蛋白浓度。 总体而言，DigitISA平台可以同时提供单体-适体相互作用的亲和力信息，确定天然蛋白质凝聚体的浓度及其质量密度，检测每个凝聚体的适体的计量比，并确定适体到蛋白质凝聚体中的分配系数以及凝聚体内的蛋白质/RNA比率。
生物分子凝聚体的DigitISA免疫检测。 图片来源：Nature communications 总结与讨论 研究团队介绍了光流体DigitISA平台，并详细介绍了其工作原理和实验实现。首先探测生物分子生物素-链霉亲和素结合复合物来建立和验证DigitISA测定，并通过定量IgE-适配体结合来证明其在生物医学分析中的适用性，表明DigitISA以皮摩尔灵敏度实现了溶液中单分子蛋白质的检测和定量。进一步使用DigitISA检测α-突触核蛋白原纤维的存在，以及α-突触核蛋白低聚物的无标记检测和分析，并通过提供适配体-低聚物结合价的估计来提供低聚物免疫化学信息。进一步证明了DigitISA技术检测和量化复杂多组分系统（包括外泌体和生物分子凝聚体）中蛋白质的能力，证明了DigitISA平台可以同时确定溶液中凝聚体的绝对数量，确定凝聚体中天然蛋白的浓度及其质量密度，检测每个凝聚体适体的计量比，确定适体与蛋白质凝聚体的分配系数，并提供单体与适体相互作用的亲和力信息。总之，实验证明了DigitISA平台在实现蛋白质生物标记物的多模式溶液内定量方面的多功能性，包括传统免疫传感技术无法解决的目标。 尽管DigitISA平台取得了进步，但仍存在一些基本限制。与其他技术一样，包括类似ELISA的方法，DigitISA需要探针，因此在进行探索性无假设研究方面受到限制。此外，DigitISA在其当前的实现中不是高通量，然而，可以采用工程方法将基于芯片的技术转化为高通量技术。最后，在专用仪器广泛应用之前，DigitISA需要在先进微流体和单分子光学方面的专业知识以及购买相关设备。 总之，本文介绍的微芯片DigitISA平台不仅能够在复杂的传感场景中对蛋白质进行高度敏感的数量-浓度定量，还能够以单一测量和数字方式表征免疫化学价和化学计量、表达水平，以及检测多种蛋白质状态、确定分配系数和亲和力信息。预计，DigitISA方法在检测和量化生物分子和生物医学相关目标方面具有广泛的适用性，在传感天然凝聚体方面具有广泛的未来应用，并可能成为搜索和优化蛋白质凝聚体亲和探针的有用工具。 |
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