低成本的CRISPR检测

快速准确的诊断对于有效治疗、预后评估和控制许多疾病至关重要。然而，全球近一半的人口获得分子诊断的机会有限。因为其成本低、通用性和易用性，基于CRISPR的分析可以解决全球贫困、农村和边缘化社区中长期存在的诊断问题。

CRISPR-Cas和引导RNA（gRNA）复合物可以识别和切割外源核酸序列。这些复合物的特异性可以很容易地通过gRNA置换来调节，这导至它们在基因编辑应用中以及后来在高特异性超灵敏核酸检测中被迅速采用。尽管CRISPR核酸检测方法具有鲁棒性，能够检测复杂生物样本中的稀缺目标，但目前大多数CRISPR核酸的检测方法都不符合世界卫生组织的POC检测的“ASSURED”标准，该标准要求在偏远或资源有限的地区进行可负担、可交付和可用的检测。

核酸提取：大多数CRISPR检测涉及核酸提取和目标扩增步骤，需要昂贵的材料、设备和对人员的培训。对检测方法的改进可以通过简化检测工作流程和仪器，但同时必须保持检测性能。例如，优选使用试剂和/或热从临床样本的细胞、病毒或核酸复合物释放核酸的无提取核酸分离方案，因为CRISPR反应耐受生物样本中存在的因子。简化的亲和程序也可用于浓缩稀缺的核酸靶点，并从抑制因子中纯化它们，以解决敏感性问题。类似地，限制小体积CRISPR反应的方法可以加强信号生成。该策略对于从液体活检中捕获的细胞外囊泡中的核酸靶点的原位分析特别有用，可诱导其与承载试剂的脂质体融合。

核酸扩增：单独的核酸扩增步骤增加了测定时间和复杂性，并在样品转移至CRISPR反应期间引入交叉污染风险。或者，核酸扩增和CRISPR反应可以分别使用微流体装置或具有优化的反应参数的单孔反应在没有流体转移的情况下连续或同时进行。消除目标核酸扩增步骤可以减少检测时间、成本和污染风险，但需要超灵敏的信号读出系统以确保可接受的化验性能。例如，使用不同CRISPR-Cas和gRNA复合物识别同一核酸靶点中不同位点的多重检测可以提高无扩增CRISPR检测的性能，但同时增加检测成本并降低与增加靶点数量成比例的特异性。

因此，与其简化单个步骤，POC应用的改进应侧重于将CRISPR测试程序系统地集成到用户友好的设备中（如下图），如微流体芯片或侧向流动分析。这种方法也可用于开发可穿戴设备，可作为疾病诊断或环境暴露的多重测试。

目前，敏感和定量的CRISPR检测信号读出主要依赖于复杂实验室设备检测到的荧光或电信号变化，这在资源有限或远程环境中是无法使用的。然而，基于纳米材料的比色传感器可以很容易地集成到CRISPR检测中，以取代荧光信号输出。在这些测定中反映目标核酸丰度的颜色变化可以用肉眼读取，但不能提供定量数据。然而，标准稀释对照可结合到这些测定中，以在通过肉眼或普通、便携式和廉价设备（包括智能手机）读取时提供半定量或定量结果。值得注意的是，这些设备的网络连接允许与国家机构或中央医院实时加密数据共享，以促进流行病学调查、疾病控制决策，并启用远程医疗计划，从而改善偏远、资源有限或服务不足地区的患者护理。

新CRISPR检测的报告通常缺乏准确评估其诊断性能和临床效用所需的严格临床验证数据。大多数研究使用小规模的回顾性样本队列来报告诊断敏感性和特异性，这可能会引入数据伪影，特别是如果未以适当的方式收集或处理分析的样本。旨在验证CRISPR分析诊断性能的研究需要适当的参考标准，因为高灵敏度CRISPR分析可能会超过参考临床分析的诊断性能，因此需要与综合多个临床试验或发现结果的复合参考标准进行比较。还迫切需要开发和采用经标准验证的CRISPR数据分析方法，以实现统一的数据报告和不同CRISPR分析结果的比较。

在考虑资源有限的设置时，需要考虑运输和存储方面。冻干CRISPR试剂可在4°C下储存5个月以上，在室温下储存30天，而不会造成性能损失。然而，对于在更可变的环境温度条件下的试剂稳定性知之甚少，标准试剂稳定方案的开发和采用将大大有助于POC CRISPR检测的开发。在其开发初期，作为最低要求，新的POC测试应评估和优化试剂冻干和再水合后的测定性能，以在缺乏强有力的冷链管理的情况下延长其保质期。

最后，需要为CRISPR试剂和CRISPR检测建立简化的专利许可和市场授权程序，以标准化和扩大生产，降低分析开发和生产成本以及市场进入壁垒，并使供应链多样化和稳定。鉴于CRISPR诊断的潜力，建议简化这些流程，就像在新冠肺炎疫情早期SARS-CoV-2 PCR诊断一样，当时多个国家的政府当局使用紧急使用授权政策来扩大检测能力。