自人类基因组草图发布以来，100美元完成一个基因组已成为DNA测序领域的一个全世界不间断去追求的目标。2014 年，测序巨头Illumina 宣布他们的新机器HiSeq X Ten可以实现每个基因组1000美元，这是标志着测序市场进入以量换价，进入集中化服务年代的一个标志性的事件。2020年，华大智造声称其DNBSEQ T10x4平台可以实现100美元基因组测序。相比于本世纪初问世时每个基因组9500万美元的成本来说，我们在过去的二十年已经实现了基因组测序上一个个重要的里程碑。 在过去的大半年，我们似乎已经无限接近了100美元基因组这个目标，一些初创企业也加入了测序巨头之间的逐底竞价较量。 初创公司Ultima Genomics在去年夏天跳出隐身模式，野心勃勃地宣布了其测序平台UG100可以实现100美元基因组；巨头Illumina在去年9月份发布了高通量NovaSeq X系列，通过今年下半年再发布的25B流通槽即将实现200美元基因组；华大智造在今年的AGBT大会上发布了DNBSEQ-T20x2标准化平台，也将在今年下半年兑现100美元基因组的承诺。 Ultima Genomics暂时还没有发布太多关于其双开门冰箱式测序仪的产品及商业化信息，但如果看NovaSeq X及T20的200/100美元基因组，就会发现这种价格的降低是需要通过测序工厂式的规模来实现的，且需要高额的前置购机成本。NovaSeq X需要每年跑满2万个样本，而T20需要跑满5万个样本，才能最终达到单位基因组的低成本承诺。
这跟发生在很多领域的规模经济如出一辙，以量换价。道理很简单，就像到了春游的季节，一车人同行，如果50座大巴包车一天花费5000块，平均到每个人身上就是100块的成本，而如果坐不满则需要每个人均摊增多。怎么样才能降低人均花费呢？能不能增加车内座位（搞个双层），这样可乘载的人数就能提升？如果成团人数暴增，需要租两台、三台大巴车，这样是不是可以协商每辆包车的费用少一些？所以整体上只有规模提升了，单位成本才能降低。 测序工厂也是如此，在正常的测序实现基础上，要不提升测序芯片单位面积的信号点密度，要不实现多个测序芯片同时运行，通过增加测序的样本量和产出的数据量来降低单个样本的测序成本。NovaSeq X和T20都显著提高了芯片/载片的信号密度，同时通过并行2张或6张芯片的模式来进一步提升测序通量，最终实现逼近100美元基因组。 革新测序化学也能降低测序成本？ 提升测序通量的确能够降低单位的测序成本，但对于样本量没有那么多、凑不满测序仪开机的实验室来讲似乎就享受不了低成本的测序。 上面类比有一个前提就是，大巴及测序仪的购置成本是不计算在内的。如果先抛开测序仪的成本不讲，测序的成本包含哪些？这就来到了消耗品的成本，包含试剂、专门的化学物质和发生在仪器上驱动 DNA 测序的奇妙反应的生物成分。 对于典型的SBS化学来说，聚合酶和修饰的可逆终止核苷酸是核心。之前的文章也专门描述过这种修饰核苷酸的结构，连接了阻断聚合的叠氮基团和可切割的荧光基团。聚合酶需要经过专门的定向进化和筛选以提高聚合反应效率，含有不同荧光基团的四种修饰核苷酸同样需要经过多步的化学反应来合成。在传统的集成式测序系统中，流体系统可以控制液体的泵入和流出，在每个测序循环中四种修饰核苷酸都要被泵入、聚合掺入延伸链、洗除然后进行碱基的荧光信号检测。洗除后的修饰核苷酸不会再重复利用，因此随着传统2x150个测序循环的进行，这些修饰核苷酸的需求量通常要到微摩尔范围内。
目前来看，由于修饰核苷酸大多局限在测序这一特殊应用，其大规模生产的工业基础并不具备，因此每家测序仪厂商多会自己构建合成修饰核苷酸的工艺路线和生产能力，以备自家自用的稳定供应。这本身并没有享受到规模生产所带来的市场化低价。 基于传统SBS化学的创新虽然可能不是把解决上述局限性作为开发的重点，但从结果上来看的确提供了一些成本优化的方案。 创新的结合测序把核苷酸掺入与碱基信号探测的步骤剥离，并非是通过可逆终止子掺入的同时就进行探测，所以这样就不需要在一个核苷酸上同时添加荧光基团和阻断基团。这降低了两段修饰核苷酸的合成难度，因为涉及化学反应的步骤减少，相应提高了合成效率，因此单一修饰的核苷酸合成成本也随之降低。 这本质上就是Pacbio Onso所实施的测序化学，但其还是沿用了上述液体控制的思路，将四种修饰核苷酸液体改成了8种，虽然可以实现更准确的碱基识别（Q40的水平），但每个反应中所要消耗的核苷酸量并没有降低。Pacbio最近公布了这一测序化学的定价，最终每个Gb的成本在15美金，放弃了参与100美元基因组的竞争。
与Onso化学类似的是另一家初创公司Element Biosciences，虽然在核苷酸掺入上使用了相同的阻断修饰核苷酸，但在碱基探测这一步，Element Biosciences别出心裁，创造了亲和子修饰核苷酸Avidite，与传统的一个碱基连接一个荧光团不同，Avidite像八爪鱼一样通过一个荧光基团外挂了多个（4-8个）相同碱基，由于其滚环扩增所形成的polony的紧凑性，使用Avidite提高了碱基识别的置信度和准确率，但最重要的是这大大降低了修饰核苷酸的使用量。Avidite的设计使得反应中修饰核苷酸的使用量降低近1000倍至纳摩尔范围内，这无疑也大大降低了试剂使用的成本。
就像之前文章分析的，两步结合测序的最主要优势就在于提升了碱基识别的准确率，将传统SBS的Q30准确率提升到了Q40的准确率，将错误读取的概率降低了一个数量级。这样一来，也许可以进一步降低测序深度，而保持与Q30水平下一致的测序精度。这对于某些对于检测精度要求很高，同时测序深度又很深的应用，尤其可能带来进一步的成本下降，比如MRD的应用等。同时，人的基因组也许将不再需要传统的30x测序深度/100Gb数据量。如果Q40的原始准确率真的能将传统SBS测序所需的覆盖度降低几倍，那么相应测序的成本下降也将是显著的。所以你看，像Avidite已经能降低在现有测序模式下的试剂使用成本，随着市场教育，如果基于Q30计算的测序深度的概念不再那么根深蒂固，那么其还有可能进一步降低每个基因组测序的成本。 当然如果将测序的四色检测降维到两色或者单色，其对于修饰核苷酸合成的要求及成本的降低也都会是显著的。所以不管是NovaSeq X还是T20都采用了两色化学，但因为两家公司在两色化学的专利纠纷和和解授权在前，不知道其他厂商敢不敢贸然进入到两色化学的开发上。 测序试剂只是耗材的一部分，另一个重头就是flow cell流通槽。流通槽中的芯片基材多为玻璃或者硅晶片，硅晶片自然比玻璃基材成本稍高。但硅晶片可以借力逐渐成熟的芯片工业基础，方便进行加工蚀刻开发出规则图案化（patterned）的测序芯片。与之相对应的是，随机芯片由于不需要蚀刻加工，成本会更低一些。 所以，简单来看，测序化学的创新、修饰核苷酸的策略加之测序芯片设计的多元组合选择很大程度上构成了测序耗材成本的基本限制。 台式中通量测序仪AVITI加入200美元基因组俱乐部！ 回到桌面式中等通量测序仪上，对比现行的几个平台，的确会发现，如果想要在“以量换价”模式之外实现测序成本的下降，就必须创新测序化学/降低修饰核苷酸的需求，并且需要在最大化信号密度的情况下降低芯片加工的复杂度。
从通量、灵活性、测序质量、测序成本等维度综合来比较，Element AVITI似乎实现了最佳的平衡，每Gb的测序成本降到了5美元，远低于竞争对手NextSeq 2000，也逼近了NovaSeq 6000的测序成本。从Element公司最近在AGBT上公开的消息来看，今年三季度将推出2x300bp的试剂盒，预期每次运行的数据量产出还会提升。而事实上，Element在今年初的时候已经宣布推出200美元基因组，领先Illumina半年实现了可及，当然从5美元降到2美元是通过绑定样本量的规模销售来实现的（客户需要承诺每年总共相当于 3000 个基因组的数据量，这需要大概3-5台仪器实现）。
ARK投资的西蒙·巴尼特最近也发表了一篇短评（见参考文献），指出Element的创新化学支持其可以实现相对更低的资本性支出，这是把仪器的资本支出按照5年使用期进行了摊销。对比可以发现，AVITI 系统生成数据的成本几乎与 Illumina 的旗舰系统 NovaSeq 6000 一样低，但资本成本却低 70%。除了降低数据成本外，更快的批处理也是 AVITI等桌面操作系统的另一个优势。像 NovaSeq 这样的传统高通量测序仪需要在测序运行之前对数十个样本进行混样批处理，从而延长了周转时间。未充分利用的机器增加了数据生成的成本，有损实验室的经济效益。但由于 AVITI 系统降低了所需的通量，实验室可以平衡仪器利用率和周转时间，同时以接近行业领先的成本生成数据。
我们可以做个简单的计算，按之前Illumina高通量测序仪的平均更新速度3年计算，同时将试剂和维保服务的成本计算在内，如果按照$2/Gb计算成本，以3台AVITI 3年产生900Tb数据计算，总成本算下来是： 75万（仪器）+180万（试剂）+15万（维保）=270万美元；而将同样的样本量换作使用NovaSeq X，则是125+180+25=330万。所以，如果你恰好每年有3000这样范围的样本量，AVITI绝对是一个不错的选择。样本量在 4000-5000 之间（需要五个 AVITI），价格是相同的。而进入到更多的样本量区间，就进入到MGI还是Illumina的比较了。 换个角度讲，如果是测序服务商，如果真的是2美元的价格落地，可能就需要认真考虑自己的服务策略了。多元化竞争意味着能够交付2美元/Gb的测序仪都得配置，毕竟中等通量不用凑样对于紧急样本或者补充高通量之外的测序需求来说还是很关键的。最终，超高通量测序工厂叠加桌面式中通量测序仪才能满足更大的服务灵活性。 还能不能持续降低测序成本？ 当然，商业是一个人为驱动的行为，但商业的最终目标都是为了盈利。Illumina近几年的整体销售毛利率基本上都维持在70%左右，这包含了多种营收来源，但如果集中到测序耗材上，据说毛利率能达到惊人的90%。这样的利润空间使得Illumina后续在面对竞争、在产品定价上拥有极大的自由度。但我们上面讨论的都是希望在保持较高利润率的前提下尽可能地去控制成本，而不是纯粹为了追求市场低价去牺牲可能的利润（后来者大都会去对标Illumina的运营效率）。 但商业化竞争的加剧使得每家企业都要努力优化各方面的成本结构和运营效率才能保持较高的利润率水平。回到核心测序化学上，各家公司一定还会持续优化以尽可能降低COGS。开发新的修饰核苷酸合成工艺路线，提升芯片可承载的信号密度，改进芯片的蚀刻工艺，这些都将能推动成本的渐进式下降。此外，不管是Ultima的光盘旋转式分液还是T20浸没式生化反应，都为减少液体使用量提供了创新的思路。同样，芯片或者核苷酸可能的重复使用也大概会进入思考开发的视野。 需要指出的是，这里讨论的成本只是测序耗材成本，没有包括其他的成本，如仪器的前置购买费用、每年10%的维修服务费用、仪器的折旧摊销、可能的建库成本以及下游生物信息学数据分析的成本，等等。如果把这些成本都计算在内，似乎我们离100美元的实际基因组还相差甚远。 100美元基因组的终极追求：人人可及！ 但问题是，为什么100美元基因组这么重要？ 设想，如果基因组的成本降至 100 美元，那么对人群进行测序就变得经济可行，而且定期对人进行测序以作为基于血液的预防性健康检查的一部分也变得切实可行。到了这个阶段，我们就有效地实现了所谓的测序民主化，以至于即使是非常小的实验室或者个人也可以拥有测序仪开展独立的测序。就像智能手机和移动互联网一样，这种民主化将显著扩大测序在全球内各个领域的影响。 最终，100美元也只是起步阶段，如果我们能再次革命性地降低这个成本。梦想就是让全基因组测序成为临床上无需动脑筋的事情，不管是确定牙疼的原因还是查看脱发的风险。但从另外的视角看，100美元基因组时代也将裹挟着意想不到的挑战，我们后续文章再做讨论。 基因组测序的实用性在 2020 年得到了真实世界的检验。当大流行来袭时，科学界对 SARS-CoV-2的基因组进行了测序，mRNA 疫苗的制造商使用该序列在几天内开发出可行的候选疫苗。这些候选疫苗后来成为获批疫苗中的两种，在过去两年中估计挽救了数百万人的生命。
到今年末，我们将真正看到100美元基因组，这将率先在测序工厂的超高通量测序模式下实现，不管是通过UG100还是T20。在以量换价的游戏之外，Element Biosciences等公司已经将测序成本推进到了2美元/Gb的范围内，这可以通过已经发布的中通量的台式测序仪来实现，所以很多中小型实验室可及。 但真正的问题是，我们可能在台式测序仪上实现100美元基因组吗，不需要考虑样本量或者凑样的那种？这会是在明年？还是未来三年？五年？ 最后，本文的讨论不包括纳米孔等其他测序方法的根本性创新所带来结构性成本降低；本文内容受到Abizar Lakdawalla推文的启发，并参考了Albert Vilella汇总整理的NGS数据，在此一并感谢！ 参考： https://ark-invest.com/newsletters/issue-354/ |
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