HaiGene全新升级 — 热启动Bst 4.2 LAMP扩增试剂（冻干球）

（1）试剂反应温度提升到70℃，提供更加严谨的引物配对条件，大幅降低了引物Dimer效应。在此条件下，引物筛选难度大幅降低，利于研究及开发人员的引物筛选。除此外，高温反应使得粗样本的核酸释放更加充分，易于核酸免提取检测，且致病菌毒灭活更加充分。
（2）试剂中加入了HaiGene最新开发的Helicaser（解旋因子），使得“哑铃”结构底物的形成，可以依靠Helicaser来完成。因此，标准LAMP中的F3/B3引物可以完全移除。同时Helicaser具有协助解链的功能，使得FIP/BIP引物使用浓度进一步下降。此项实验方案由HaiGene测试建立，并命名为eLAMP (Easy LAMP)。

（3）高亲和力的HotStart Aptamer确保聚合酶30℃以下，酶活残留<5%，热启动效应远高于N公司制品。高亲和力的Aptamer使得反应体系易于建立，并维持均一的扩增性能。

（4）全新开发的L-HNB显色技术（Leuco-HNB），解决了HNB反应完毕后，颜色对比不明显的问题。同时保留了HNB对缓冲液、样品的耐受度的优点。该变色方法，适用性远优于基于pH变色的可视化法。

1、Bst 4.2 HotStart功能展示

采用荧光酶活测定法在30℃和60℃条件下测定HotStart Bst 4.2，结果显示与未加入Aptamer的对照比较来看。HotStart Bst 4.2在30℃条件下酶活几乎无活性，而60℃条件下1min内酶活完全释放，恢复100%活性。

2、以Bst 4.2 SYBR Green试剂进行标准LAMP和eLAMP扩增比较

以human Total RNA为模板，采用RnaseP LAMP Primer进行标准LAMP和eLAMP 扩增。在25ul扩增体系中加入10ng、1ng和0ng的RNA，70℃反应40min。从扩增结果可获得，在Helicaser的加持下F3/B3可完全去除，对扩增速度几乎无影响，并且非特异性扩增得到改善。6 Primer LAMP引物浓度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM; F3/B3=0.1 μM。4 Primer eLAMP引物浓度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM。

3、以Bst 4.2 Basic试剂进行DP-eLAMP探针法扩增

在众多的探针法LAMP测试中，DP-LAMP探针法(Displaceable Probe LAMP)为HaiGene推荐的使用方法（参考PMID: 33626039）。在LAMP扩增中将LF或LB引物退火至互补的猝灭oligo，利用链置换活性获得游离的荧光信号（可参考HaiGene A3831-21说明书资料）。该方案可进一步降低LAMP的非特异扩增。下图为DP-eLAMP进行三种荧光标记探针的实验数据。结果显示HotStart Bst4.2总能获得高特异性和高重复性的扩增。

4、以Bst4.2 L-HNB 试剂进行L-HNB (紫罗兰-淡绿) 变色反应（肉眼观察）

以2019-nCoV体外转录RNA为模板，采用eLAMP扩增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 对10000、1000、100、25copies/管的阳性RNA进行检测，ddH20为阴性对照（4重复）。下图为70℃反应30min 后的检测结果。结果表明L-HNB法获得清晰易于区分的颜色变化，极易区分阳性和阴性扩增。

5、 以Bst4.2 L-HNB (紫罗兰-淡绿) 变色反应对反应缓冲盐Tris的耐受性测试

以2019-nCoV体外转录RNA为模板，采用eLAMP扩增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 对1000copies/管的阳性RNA进行检测（2重复），ddH20为阴性对照（2重复）。下图为70℃反应30min 后的检测结果。结果表明L-HNB法，在1x浓度下可耐受10mM Tris-HCl的缓冲盐，阳性样本仍然可以充分的变色。该变色方法不受样本中缓冲盐影响。

6、 以Bst4.2 Red试剂进行LAMP红黄变色扩增

以2019-nCoV体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、104和106Copy，NTC为ddH2O为模板。上图为加样结束反应起始前，下图为70℃反应30min后。

7、 以Bst 4.2 Basic试剂搭配 OG 橙绿变色反应管（A3821）

以2019-nCoV体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、104和106Copy，NTC为ddH2O为模板。上图为加样结束反应起始前，下图为70℃反应30min后。

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