【冯仁丰】免疫散射和透射比浊需要全新的参考物质 1

上世纪80年代到90年代，临床免疫学上出现了新的测量样品中蛋白质的方法，即免疫散射和透射比浊方法。免疫比浊方法完全颠覆了原先的临床实验室都样品中某个特定蛋白检测技术和水平。之前，免疫学检测蛋白质的方法，大多还只能是定性水平；使用抗原抗体的免疫扩散技术，实现了定量检测。但是，这个免疫扩散方法必须在每一个准备到分析的所有步骤，都非常认真下，在技术熟练的实验室人员操作和观察下，方能得到可靠的结果。大量样品需要得到某些蛋白质的定量结果，必须使用免疫扩散方法。但是这对于一般实验室做不到。当时，我听到和看到的上海临床实验室检验人员，普遍认为，免疫扩散方法学必须淘汰！尽管这个检测技术在国际上被认可为检测血液样品内蛋白质的可靠参考方法。

免疫散射比浊方法很快被体外诊断厂商接受，设计产生了免疫散射比浊的专用分析仪，并且形成了系列抗体试剂，推向市场。但是，一个很棘手的问题是，如何形成国际认可的新参考物质？它必须是完全透明和洁净的！在当时，还没有一个国际认可的蛋白质参考物质，具有这样的条件！为此，国际临床化学联合会（IFCC）组织了一次研讨会。专门商量如何实施制备这样的参考物质。

我有幸认识德国原Behringer公司知名的蛋白质专家Dr. Francesco Dati。他原先是公司的IVD咨询专家。他和Dr. Metzmann长期共事，在Behringer公司为推出散射比浊分析仪和系列试剂做出了很多贡献。为此，他一直被IFCC和欧洲联盟聘请为专家。

上世纪，他给我一个报告。说明当时IFCC正在筹划形成一个新的蛋白质参考物质。这是在国际上正式形成著名的ERM-DA470（原CRM 470）之前，专家对形成蛋白质检测参考物质的设想和要求。以后，很多这个会议上的认识和考虑都成为现实！

因此，以下，我将这次会议的内容介绍给大家。

这是1989年5月17日的会议。

与会的有来自法国、瑞典、英国、美国专家。还有美国Beckman、德国Behringwerke、丹麦Dake、和比利时的欧洲共同参考管理局等专家。

讨论内容

A 一致同意使用的词语和定义

1）一级标准的定义（纯蛋白质）。

2） 一级具有基质的国际血清蛋白质参考制品（含血清为基础的、和没有蛋白的混合物）（1* IMRP）的定义。

3）二级具有基质的国际参考制品（公司的一级校准物）（2*IMRP）的定义。

4）三级具有基质参考制品（诊断公司销售的校准物）（3* MRP）的定义。

5）需要仔细形成所有用于制备1*IMRP的文件和发布。并准确地叙述对2*IMRP值的转换的方法。

B 具基质校准物的稳定化和制备

1）叙述由Dakopatts制备的IFCC工作校准物（参考校准 IFCC 0888）。

C 参考制品的校准方法

1）从一级标准向工作基质物质的转换方法。

2）一级标准的回收率。

3） 一级标准与二级具基质参考制品和病人血清，与蛋白物理化学和免疫性质关联的可比性。

4）使用国际单位或质量浓度。

D  WHO的免疫球蛋白参考物质的经验

   Lot.No. 67/86 -- 67/98c -- 67/98B -- 67/98D2

详细讨论

E 具基质校准物的稳定化和制备

1）二级具基质参考制品（血清或血浆？）的规范

  -- 目前，必须使用正常血清。

  -- （若可能，液体制品）。

 要求真正的天然血清，去制备校准物，为了避免可能的血清浑浊，影响透射比浊和散射比浊。这样的浑浊经常发生在从血浆得到血清的重新钙化引起。

2）一致同意血清蛋白应声明在具有基质的参考制品内，即IgM、IgA、IgG亚类、总轻链（κ+λ）、触珠蛋白、转铁蛋白、白蛋白、前白蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1抗胰凝乳蛋白酶、α2巨球蛋白、铜蓝蛋白、补体组分C1抑制剂、C1、C2、C3、C4、C5、C9-，α1酸性糖蛋白、血液结合素、α1微球蛋白、β2微球蛋白、RBP、CRP（若可能）、和最后TBG、CBG、SHBG。

3）选择健康血液供体的指标，以得到特定的献血（250 ml全血产生100 ml血清），和其他。

  a）餐前血液献血（接受扎脉带）。

  b）抗HIV 1+2、HBsAg、和HTLV I阴性（采用Western Blots）。

  c）电泳分析无单克隆成分。

  d）定量检测类风湿因子 ＜30 IU/ml。

  e）无黄疸、溶血、和脂血（目视检查血清样品做出决定）。

4）血液收集物流

  --四个中心收集血液，即：英国（Milford Ward）、法国（Bienvenu）、德国（Behringwerke）、和可能奥地利（Immuno）、意大利（Aguzzi）、或斯堪的纳维亚（Scandinavia）。

  -- 每个中心将召集60名血液供体。每名供体献血250 ml全血，以得到约100 ml血清，总共约24 L（最后目的为20 L）。

  -- 总的混合血清将保存在4℃液态。10%的混合血清应深低温，部分处于-80℃（8%），部分冷冻干燥（2%）。

5）记录每位供体信息（如，年龄、性别、血型、表型如：触珠蛋白和α1抗胰蛋白酶）。

6）收集和处理血液样品的每个步骤（离心收集，使用各个玻璃瓶，适合离心，弃去第一个20 ml，在室温凝聚1小时，离心1000 g，20 min）。

7）方法：a）保存，b）脱脂/离心，c）过滤，d）分装安瓿

  a）添加叠氮钠（15 mmol/L）和苯甲脒（5 mmol/L），和也许两性霉素 B和抑制素（蛋白水解酶抑制剂！）。以后，冰浴运送到一个中心，在那里，将各个血清混合一起（可能在Behringwerke/Marburg）。

  b）添加稳定物质，在控制pH和盐浓度下脱脂，或超离心 10800 g 24小时。 [在混合血清前，应先进行一次离心。需要检测纤维蛋白原。若纤维蛋白原浓度＞20mg/L，该血清应弃去。]

  c）无菌过滤，滤膜0.22 μm，调节pH到7.4。在运送前再次添加叠氮钠（5 mmol/L）。

  d）分装安瓿，约1.1到1.25 ml。并封口（在Behringwerke进行练习）。

F 对具有基质的校准物和控制物质设定值的方法

1）值转换方法的讨论

  a）对IFCC值转换文件草案讨论。

  b）使用放射免疫扩散方法将纯蛋白转换到参考物质的模式。

  c）确定值转换方法的唯一要点！

质量/精密度/准确度/相对能力/平行性/动态范围-- 灵敏度/随时间稳定性/可定义的方案/发现系统误差。

  d）在上述提及要点前，回收率对于从纯蛋白到1* IMRP （第1步）的值转换非常重要，在使用选定的“参考方法”（或两个）中，在使用推荐方法，从基质的到基质校准物的值转换的平行性（步骤II和III）中。

  e）步骤I（纯蛋白到1* IMRP）和步骤II（1* IMRP到2* IMRP）的值转换方法，必须在不同实验室内是特定的和被确认的；在步骤III（2* IMRP到3*MRP）中，一些方法只能建议。

  f）被认可的方法的蛋白标准化：干燥质量测定和确定的草案文件（Blirup-Jensen/Svendsen）。

  -- 纯蛋白制品和被干燥质量测定标准化，以氨基酸和碳水化合物分析支持。

2）纯蛋白的特性

   -- 不仅使用已知的物理化学技术，而且还有一些免疫化学方法（如，双向免疫电泳/免疫印迹法）

   a）纯度程度；

   b）异型异质性；

   c）聚集和解离的程度；

   d）结合物质（bound substances）/配体

   e）以不同来源的单独抗体，检查“抗原”（免疫探针类型）。

   f）为确定一些纯蛋白质的特性，如：IgG亚类，必要的单克隆抗体。

3）为值转换选择实验室

   -- 若BCR将参与该计划或具基质基质物制品，BCR要求承担确认责任

   -- 在组织release发布参考物质下，将选择值转换练习的实验室，考虑IFCC专家组的建议。

   —如果BCR决定参与该计划，BCR应签发系列合同。

G 宣布参考物质的研究机构

  -- 宣布的研究机构是BCR（欧共体参考局Bureau Communitaire de Reference）和CAP。

  -- 但从法律上考虑，他们将仅考虑国家问题。

H 讨论管理和主要重要目的的项目

  -- 任务的分配和时间计划。