【冯仁丰】CRM 470参考物质的介绍

CRM 470是一个以血清为基础的多个蛋白质参考物质。CRM即Certified RM翻译为有证的参考物质。

1993年欧共体委员会发布了临床实验室专用的CRM 470参考物质证书。

对该参考物质的认证工作由法国Hospices Civils de Lyon里昂民间临终关怀免疫学实验室（F）、和英国Leeds大学化学病理学和免疫学部（英国），代表欧洲共同体委员会共同体参考局 (the Community Bureau of References (BCR) of the Commission of the European Communities)实施，然后在布鲁塞尔（B）发布了认证内容。这个文件的名字为：14种人血清蛋白质免疫化学检测用具有基质参考物质证书（The certification of a matrix reference material for immunochemical measurement of 14 human resum proteins）。

这个文件以后事实上成了CRM 470产品说明书。它连同发售CRM 470参考物质一起，发送给所有使用者。我有幸看到并阅读了这份珍贵的文件的有关信息。以下我做一个简短的摘要介绍。

报告摘要

本文件叙述了制备、确定特性、和确认一个新的人蛋白质冷冻干燥血清参考物质采取的步骤。在该项目方案每个步骤，包括了供体选择、收集血液、保存、运送、处理和值的转换等内容，均仔细地形成了文件。

在产品被应用在大西洋两侧超过30个实验室，进行广泛的免疫化学值设定练习；很清楚，该物质符合了原定方案中设定的性能规范。产品展现了稳定性和均一性。

对该物质蛋白质设定的值，有α1-酸性糖蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、白蛋白、C3补体、C4补体、铜蓝蛋白、C-反应蛋白、触珠蛋白、免疫球蛋白IgA、IgG、IgM，转铁蛋白、和前白蛋白。α1-酸性糖蛋白、α1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、和前白蛋白的定值，相对于高度纯化的蛋白，以最先进方法实施。以往前白蛋白没有被设定相对于任何可信参考制品的值。

多个以往的计划已经得到了可用的参考物质（RM），适合当时技术和临床需求。诸如WHO、IUIS（国际免疫协会联合会）、美国疾病控制中心（CDC）和美国临床病理学会（CAP）等机构，还依然提供这样的可靠物质。

但是，这些RM出现问题的普遍认识，提示对新产生的血清蛋白RM的要求：

- 物质原料应由已知人群分配的样品组成。

- 应消除含有危害的传染原的样品。

- 物质应按照严格公开和可重现的方案制备。

- 应展现长期稳定性（至少5年）。

- 它应具有与常规临床样品的特性有紧密的相似性，蛋白应尽可能接近天然状态，与长期稳定性一致。

- 对物质设定值中应使方法具有的偏移为最小或不存在。

- 它应具有高度透明洁净。

- 该物质应有很大量可用数年。

- 对新分析物浓度值的设定，尽可能，要针对纯化蛋白检测设定。

- 尽可能，它应相对于可接受的和依然可行的RM设定值。

使用特别收集的供体血液，制备冷冻干燥的、稳定化的人血清。以现有的国际参考制品或纯化蛋白质设定值。WHO的血浆蛋白质标准设定的是国际单位，美国国家参考制品（USNRP）或纯化蛋白质的为质量值。

为设定值使用的方法为散射免疫比浊、透射免疫比浊、或放射免疫扩散（RID）。

设定值的方案和数据处理统计方法，在一个值设定练习中进行了检测。为了使所有参加定值实验室的定值方案一致，要求形成完整方案。包括校准分析设备的说明、储存和复溶样品、检测蛋白质浓度、和报告结果。所有26个欧洲实验室、9个美国实验室、和2个日本实验室参加了定值工作。

原始供体血清的选择

1 物质来源的选择

要求收集健康供体的血液，适用于检测血清或血浆的人蛋白质。必须收集血清为基础的参考物质原料。

2 物质中蛋白质的定量和定性特性

为了得到天然物理化学状态下的蛋白质，必须在处理物质上越快越好。必须避免任何细菌的污染。（这个类型污染的出色标志物是，存在外部的蛋白酶，被它们直接作用在消化灵敏的蛋白质上，如A1AT、或A2M。添加防腐剂抑制某个抗微生物（叠氮钠）或某个抗蛋白酶（抑酞酶、苯甲脒）活性，是得到具有长期有效期制品很重要的。）

蛋白质的物理化学完整性应越接近天然血清越好，以确保在RM和病人样品间在检测中有相似的行为。

3 稳定程序的选择

为确保人血清的长期稳定性，必须消除某些易变成分，会在储存后免疫化学程序中出现干扰。也desirable可转换为稳定的蛋白质状态，如C3到稳定的终点产物。

HDL和LDL的易变性很明白，三油酸甘油酯有影响。必须予以消除。确保制品得到非常低的空白值。

对任何供体具有不利未来参考物质稳定或检测影响的，这些血液全部剔除。

经过小样预试验制备、检验、和观察。最后确定大批量生产参考物质的最后方案。

大批生产在无菌条件下进行分装。玻璃瓶为硅化的。分装体积正好1 ml。灌装后立即在无菌条件下进行冷冻干燥。血清被冷却到-40℃超过1小时。真空平衡为10~30 Pa、18小时。在成功步骤下加热使温度从-40℃到+25℃，在氮气下超过20小时。最后加盖（约40000瓶）。

4 经冷冻干燥后最后产品BCR/CAP/IFCC CRM 470*的质量指标

无菌试验、灌装体积的均一性、干重、残存水分含量、空白值（产品必须洁净、透明、很低的空白值）、复溶前稳定性检测、定量蛋白质含量、均一性研究、复溶后稳定性实验等。

5 血浆蛋白质浓度

以RID和BNA对BCR/CAP/IFCC CRM 470内确定了14个被选定血浆蛋白浓度。相对于健康高加索人群的参考值，为IgG、IgA、IgM、A1AG、A2M、A1AT、C3、HPT、TF和TTR。C4和CER处于较健康人群略低的浓度。该制品加入了CRP使浓度大致为40 mg/L。

  5.1蛋白质的物理化学结构观察

蛋白质的物理化学结构，在制备后即刻进行双向免疫电泳分析。以每个蛋白质成分在电泳图像确定蛋白质结构。

6 为参考物质内各个蛋白质 （trial value assignment）值设定试验

欧洲22个实验室和美国的10个实验室进行了值设定试验的练习。目的是评估值设定方案的实用性（practicability），和试验统计方法与实验室的性能。从中最后确定参加参考物质定值的实验室。

6.5 试验的结论

样品，在值设定中没有特殊问题。

方法，明确地显示了不仅方法而且抗体，在得到可靠结果中起着重要的作用。在特异性轻微变异和滴度上导至信号超出检测范围的，导至错误的结果。由此，在一个早期阶段，为被选定的仪器，就要决定使用标准化和最适抗体。所有Cobas（Roche）仪器和Hitachi仪器，仅使用DAKO，DK抗体，所有Behringwerke仪器仅使用Behringwerke的抗体。在美国和2个欧洲实验室使用了Beckman仪器和Beckman抗体。最后的结果已经展现了该转换方案，为Cobas仪器（BIO和FARA）、Hitachi仪器（704和717）、和BNA的各个方案已经形成。所有这些方案叙述了从血清基质（参考）到另一个血清基质（靶物质）的值的转换。

对于最后为CRM 470内各个蛋白质定值内容，我将如何将指定的参考物质值转换到，需要被定值的靶物质的内容。列入其他微信中。