东成西就——一部多线程发展的临床免疫检验技术史（下篇）
2022-11-9 16:05|
编辑: 归去来兮|
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评论: 0|来源: 聚拓生物 | 作者：郑喜
摘要: 那本篇就来谈一谈免疫诊断技术发展的新趋势……
也许有人会问，为什么要去了解一个技术的历史呢？掌握最新技术不就所向披靡了吗？很简单，任何一个技术的发展更迭从来都不是孤立的，都是在一脉相承的基础上做适当的创新而来的，甚至跨技术之间都可能是相互联系、彼此借鉴的。有言道，学史可以知兴替，明得失。在当下临床免疫学检测技术蓬勃发展的局面中，不免困惑不同技术平台之间的本质性差异以及在具体应用中的优劣性。万变不离其宗，让我们通过梳理整个免疫检测技术的发展历程，来了解各个技术基业长青抑或兴衰更替的背后原因以及意义。前两篇讲了经典免疫实验和当代标记免疫的发展阶段，那本篇就来谈一谈免疫诊断技术发展的新趋势……
多元免疫分析技术的发展始于上个世纪末，从名字就可以看出，多元免疫分析方法的特点是可一次性对多个待分析物进行检测，能有效降低采样偏差，通量更高，有效提高筛选质量，极大地降低了时间和分析成本。目前较为常见的主要有流式细胞术（如CBA）、蛋白质微阵列芯片技术、量子点技术以及多元均相时间分辨荧光免疫分析技术等。流式细胞术发展较早，20世纪60年代后期便开始用于细胞理化特征的检测。到80年代后期开始应用于临床，辅助诊断多种疾病，特别是白血病等血液病。
图 1997年，Luminex Corporation开发xMAP technology
随着流式细胞术的发展，出现了针对不同用途的多种型号流式分析仪、分选仪，根据配备的激光器的升级，可进行多达10色以上的荧光分析。在除了针对细胞这种颗粒性物质的检测之外，还发展了一系列用于可溶性蛋白质分子的检测技术：如Biolegend 的LEGENGplexTM、Luminex 的LabMAPTM（xMAP®）、BD的CBA。
Biolegend 的LEGENGplexTM是一种基于微球的免疫测定方法，通过双抗夹心法捕获样本中的目标蛋白，随后利用流式细胞仪分析样本所带荧光信号，实现蛋白的定量检测。试剂盒中的微球可根据大小不同分为A、B两类，每一类又可根据携带不同的类APC荧光强度分为多个小群，其中A类可分为6小群，B类可分为7小群，从而满足同时检测13种细胞因子的实验要求。 xMAP®的技术原理为：用不同配比的两到三种红色分类荧光染料将直径为 5.6 微米的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色，从而获得多达500 种荧光编码的微球。把针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上，每个编码微球都对应相应的检测项目，因此可检测多达500种不同的指标。先把针对不同待测物的荧光编码微球混合，然后加入待测物质或者待测的扩增片段，所形成的复合物再与标记荧光素发生结合反应。微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光，红激光用来判定微球的荧光编码，绿激光用来测定微球上报告分子的荧光强度。从而达到快速准确的定量检测目的。 每个CBA微球大小一致，携带不同强度的红色荧光，用以区别不同检测物质。每种微球包被用于特定分析的特异性捕获抗体，当微球与待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体与样品中的待测物结合，然后加入荧光标记的检测抗体，形成三明治夹心复合物，通过流式细胞仪进行检测。FL3通道检测微球的荧光强度差异来定性目标蛋白，FL2通道检测检测抗体携带的PE荧光强度来定量目标蛋白。
流式细胞术是发展比较完善的现代免疫分析技术，但其检测所需的设备和试剂盒昂贵，导至分析测试成本较高。2000年，Gavin和Stuart两位科学家将酵母双杂交技术与体外生化检测技术相结合，开发了基于微阵列的蛋白质功能研究方法，宣告蛋白质芯片技术发展的启动！2001年，耶鲁大学分子、细胞和发育生物学系教授兼主任Michael Snyder (现任职于斯坦福大学）与约翰·霍普金斯大学的蛋白质微阵列技术先驱朱衡博士等成功开发了被广泛认可的酵母蛋白质芯片。不久后，耶鲁大学将这项技术授权给生物技术公司Protometrix, Inc. （后被ThermoFisher旗下的Invitrogen收购）以实现产业转化。
图 Michael Snyder （左）和朱衡教授（右）等科学家发表文章 Global Analysis of Protein Activities Using Proteome Chips
蛋白质微阵列由于具有高通量的性质，在医学领域，加快了生物学标志物的发现和确认的速度、推动了针对疾病相关靶蛋白的化学药物的开发、提供了多种标志物同时检测的诊断试剂盒；在科研领域，简化了蛋白质功能研究的过程和工作量等等。因此是推动全球制药及其他行业发展的重要工具。目前，蛋白芯片技术在临床应用方面取得了一定的成绩，通过查询国家药监局网站可以看到，已有多个诊断试剂盒获得NMPA注册证，用于心脏功能、肿瘤、自身免疫性疾病和传染病方面的多重检测。
从前文可以看到，时间分辨荧光技术一般是非均相的，在反应完成后需要分离抗原抗体复合物，洗涤游离态的标记抗体，不利于设备的小型化和自动化。为了简化检测步骤，均相时间分辨荧光技术应运而生。该技术非常适用于自动化和小型化筛选类应用。
均相时间分辨荧光免疫分析的检测原理是基于荧光共振能量转移，当生物分子之间相互作用，供受体荧光基团的距离被拉近。此时，若供体被激发，它会传递它的发射光能量给受体。受体和供体的发射光具有不同的波长，可以被微孔板读板机区分。 图 多元均相时间分辨荧光免疫分析的原理图（以甲胎蛋白AFP抗原的检测为例 而多重性的实现，则需要有不同颜色荧光的能量受体来标记，通常可用到量子点，因为不同尺寸的量子点具有不同颜色，同一激发光源可以同时激发多色量子点。
目前，均相时间分辨荧光技术主要用于检测生物分子间的相互作用，而多元检测设备较少见到。
免疫学检测在往多元化发展的同时，也在往超敏的方向发展。从对目标信号的检测本质来看，现有的化学发光技术是一种宏观的、自上而下的检测逻辑，通过测量待测样品宏观信号的强度变化与目标分子浓度的关系进行定量。当待测溶液中目标物质含量较高时，这个检测方式得到的数据是可靠的；但当待测溶液中目标物质浓度低到一定程度时，光电倍增管捕获光子信号的不确定性将呈指数级提高，甚至会因为检测信号完全被埋没于背景噪音中而失去定量检测能力。因此这类方法灵敏度普遍不高，检测限一般在 pg/ml级别。要从根本上提升检测灵敏度，就需要彻底颠覆宏观信号检测逻辑，而替代以单分子策略的信号计数方式。这要涉及到免疫复合物的离散、识别和计数三个关键计数。2006 年 ，Singulex 公司报道了商品名为Erenna 的单分子计数免疫分析仪，开启了数字免疫分析的商 品化阶段；数字酶免疫分析概念由Quanterix 公司在 2010 年提出，创立了阵列微孔离散单个酶标免疫复合体的方法，将硬离散思路引入了单分子计数免疫分析中。2015年，液滴离散法被提出，使用微流控液滴对免疫复合体进行离散，可以实现对免疫复合体的完全装载。
Nat Biotechnol. 2010 Jun;28(6):595-9.
随后的近几年中，国产若干厂家积极跟进，在免疫复合物离散后的信号识别上大部分是沿用了类似Simoa的数字化成像技术。而其中值得一提的是，CCD成像计数是同时对许多液滴进行拍照，在信噪比和分辨力方面会有所欠缺。由聚拓生物开发的基于毛细管的时间离散单个荧光标记免疫复合体方法，是单独检测每个液滴，有更准确的检测性能。
首先以“三明治”式的双抗夹心法捕获并以荧光标记待测靶物质，通过自动化技术传输通过毛细管，并通过激光器和APD实现单个免疫复合体的光学信号的测量。后续以泊松分布相关的计数定量方式，预先构建标准曲线，计量免疫复合体的个数进行定量。
目前，单分子免疫测定技术主要用于神经、免疫、肿标等领域的科研、药物开发及临床诊断。未来，实现更快速度、多重化、高稳定性将是单分子研究的热点。后记：有时候，会不免困惑于在某个项目的检测上，主流会认准某个技术平台，而很少用类似性能的其他平台。之前一直执着于寻找技术本身的差异，但从历史和发展的眼光来看，除了本身技术恰当外，也有一部分原因是在这个方法学刚开始建立的时候，发明者（公司）拿它做什么，后面就会一直延续下去；并且在该领域积累多，不断深化迭代，优势就愈加明显，良性循环。其次，从市场层面看，作为先行者，先进入市场，获得认可，抢占渠道，成为主流方法学，甚至报了物价，那么后面进来的方法学是很难突破的。1、陆永绥等，临床检验管理与技术规程（第二版）20142、苏玉婷等，单分子计数免疫分析，激光与光电子学进展，2022.33、陈宇琼等，放射免疫分析与化学发光免疫检测应用对比，20144、韩刚毅等，荧光免疫分析技术的发展现状，1991
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