开发｜伴随诊断中的PCR技术

自1983年成立以来，聚合酶链式反应（PCR）已被用于生物科学的许多领域，以便研究个人的DNA。无论是确定动物或人类的血统，还是确认孩子的亲子关系，或是为被错误指控的人开脱罪责，PCR已经渗透到我们的日常生活中。

利用PCR，科学家们已经能够为广泛的医疗目的分析DNA；其中包括在移植项目中对捐赠器官和接受者进行匹配，测定和监测受感染患者和血液及组织捐赠者中的病原体，测定母体血液中的胎儿病症，以及测定血液疾病和实体器官恶性肿瘤。

在本文中，我们将强调PCR的历史，因为它与诊断学有关，重点是伴随诊断和补充诊断。本文讨论了美国食品和药物管理局（FDA）对伴随诊断（CDx）测试和补充诊断的批准。

我们还将深入介绍CDx和补充诊断的证据收集和监管审批所需的分析和临床研究的设计，特别关注成功进行临床研究的要求，这是监管机构注册的核心。

如果说有一项科学发现催生了分子诊断学，这就是1985年PCR的发明。PCR利用在自然界观察到的DNA复制原理，需要在反应管中加入DNA样本、DNA聚合酶、核苷酸、靶标特定引物和其他试剂来复制DNA代码。

该原理在1987年首次报道，包括一个PCR循环的三个步骤，使靶标DNA的数量增加一倍。经过多次循环，靶标DNA呈指数倍增，可以产生原始样品中靶标DNA的数百万个拷贝（图1）。

图6.1 | 聚合酶链式反应的试验原理。在不同的温度下进行20 -40个重复循环，包括三个步骤（变性、退火和延伸）。具体的温度和每个循环的长度根据反应要扩增的靶标来调整。

首先，在分离DNA的样品制备后（通常使用结合带负电荷的核酸的磁性玻璃珠），PCR反应包括三个连续的步骤。首先，需要变性以分离双链靶标DNA，通常通过将样品加热到90℃以上以打破形成DNA的核苷酸之间的非共价键来实现。

第二，需要发生靶标DNA序列的退火。这是通过结合PCR引物实现的，这些引物与样品中感兴趣的特定DNA序列互补。引物是专门设计的寡核苷酸，可选择性地与靶标DNA区域两侧的序列结合；每个引物都与新分离的单条DNA链中的靶标序列的起点结合。引物的结合通常发生在40℃和60℃之间的温度。

最后，用结合的引物对靶标序列进行延伸，在72℃左右的温度下产生靶标序列的拷贝。这是由DNA聚合酶实现的，它利用添加的核苷酸创造出一条与每条单一模板链互补的新DNA链。

在通过PCR的第一个循环产生了两个DNA副本后，重新开始了一系列的步骤，新复制的DNA可以在多个循环中被复制。应用引物和DNA复制过程导至的DNA的互补性和精致的序列特异性，一个试管中的DNA「复印机」就诞生了。

这些实验概念和热稳定的DNA聚合酶的出现使得DNA靶标序列的指数扩增和用标记的寡核苷酸探针测定成为可能。

1992年，AMPLICOR沙眼衣原体测定在美国以外的地区推出，一年后获得FDA的510（k）许可，成为FDA批准的第一个基于PCR技术的诊断性体外诊断（IVD）测定。1993年，卡里-穆利斯因其发现PCR而获得诺贝尔化学奖。

技术的进步导至了实时（RT）PCR的发展，在PCR扩增反应中产生的DNA在RT中使用荧光探针来测定靶标序列的存在。随着扩增的靶标DNA在每个PCR周期中的积累，扩增的DNA片段会「发光」，从而可以对靶标进行定量测定。

由于PCR和测定现在可以同时完成，而不是按顺序进行，所以得出结果的时间缩短了，人与样本的互动也减少到最低限度，从而降低了污染的风险，使这种测试适合于常规临床诊断实验室。随着分子诊断学领域的爆发，PCR很快在实验室医学中变得普遍。

在现代实验室中，传统的PCR（第一代）由于涉及繁琐的工作流程和准确性等问题，应用非常有限。随着热稳定和更精确的聚合酶的引入以及RT测定的发展（第二代PCR），PCR现在普遍应用于研究和临床实验室，以测定大量的基因改变。PCR可用于测定DNA结构畸变，包括易位、缺失、倒位和复制（见下文）。

为了实现绝对定量，数字PCR（dPCR）作为第三代PCR技术已经被开发出来。扩增前，模板被稀释到一定的浓度，并分散到若干微反应单元中，这导至每个单元中的靶标DNA序列为零或一个（图2）。

图2 | 数字PCR的原理。病人的样本被分成多个（例如，数千个）反应区间（井或液滴）。在热循环和使用PCR对靶标进行终点测定后，确定阳性和阴性区间的数量。使用泊松校正，可以计算出靶标物的起始拷贝数，用于绝对定量。PCR，聚合酶链反应。

扩增后，含有靶标DNA序列拷贝的单元显示阳性信号，而在没有靶标序列的单元中只观察到背景荧光。然后应用泊松分布来量化阳性单位的平均数量和比例，以减少一些单位中存在一个以上的靶标序列拷贝所产生的误差。

在此基础上，可以得到靶标DNA的初始拷贝数和浓度。dPCR的出现将基因突变的测定提升到了前所未有的精确水平，特别是在癌症相关的基因方面。dPCR已被用于测定不同类型癌症患者的无细胞DNA（cfDNA）样品中的肿瘤标志物，包括血浆、脑脊液、尿液和痰液等多种样品类型，这赋予了dPCR在临床应用和基础研究中的重要价值。

耐药性和异质线粒体DNA（mtDNA）的突变状态，决定了mtDNA相关疾病的表现和进展，同时也可以对单基因疾病进行产前诊断和评估基因组编辑效果。通过增加输入量，可以达到高灵敏度，也就是对罕见事件的测定，而增加分区的数量可以测定高动态范围内的靶标和罕见突变拷贝数变体。

与RT-PCR（qPCR）和测序相比，dPCR更高的灵敏度和准确性表明其在测定罕见突变方面有很大优势。然而，到今天为止，dPCR还没有被用于监管部门的伴随或补充诊断应用。

目前肿瘤学和其他领域的治疗策略正在迅速改变。靶向药和检查点抑制剂，即治疗性抗体、激酶抑制剂和聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂在大多数情况下需要治疗前的配套，或涉及补充诊断测试，以确定作为药物靶点的分子改变。

定义和确认的生物标志物，在大多数情况下是基因改变，驱动着治疗药物的疗效，因此可以识别那些可能或不可能从特定治疗中受益的患者。这些分析代表了个性化或精准医疗的基础。在治疗恶性肿瘤的过程中，有许多伴随或补充诊断的例子（在下面讨论）。

最初，几乎所有的生物标志物都是基于组织的，依赖于免疫组织化学（IHC）、原位杂交、PCR、阵列或测序。最近，外周血中cfDNA的测定已经得到确认，为临床医生提供了用于精准医疗的基因改变的相关信息。

cfDNA由细胞周转过程中坏死或凋亡后从肿瘤中脱落的双链DNA的短片段组成，其特点是正常细胞中不存在的独特体细胞突变。cfDNA的发现将增加基于PCR和第二代测序（NGS）的所谓液态活检的辅助和补充诊断的使用，而基于IHC的解决方案将继续主导肿瘤组织样本的辅助和补充诊断。

PCR方法由于使用方便、灵敏度和特异性好、结果周转及时、数据解释相对简单而受到欢迎。基于PCR的测定，如dropplet dPCR、ARMS和BEAMing，相对便宜、高度敏感和特异，但它们只能测定有限的已知突变；基于PCR的测定不容易测定拷贝数改变和重排（如ALK或ROS1融合）、肿瘤突变负担（TMB），这些通过NGS更容易测定。

相比之下，基于NGS的测定，如TAM-Seq和CAPP-Seq，具有高度的灵敏度和特异性，可以测定多种已知和未知的突变；然而，该技术仍然很昂贵，需要更长的周转和动手时间。

最近，基于NGS的CDx测试已被监管部门批准。在这方面，Foundation Medicine公司的FoundationOne CDx（F+CDx）已被FDA批准，它使用从福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织标本中分离的DNA。

在晚期实体器官癌症患者中，该测试可测定324个癌症基因是否存在基因组改变，作为CDx来指导某些类型的非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌患者使用17种治疗方法。

值得关注的是，F+CDx还被批准报告基因组生物标志物，包括微卫星不稳定性和TMB，以协助选择免疫检查点抑制剂疗法。目前，用于CDx的技术中约有三分之一是基于PCR的。（www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalPr℃edures1）。

无论应用于辅助或补充诊断的技术如何，这些测定的确认对于临床和经济上的成功至关重要。我们最近评估了实验室开发的测试（LDTs）和FDA批准的使用PCR测定表皮生长因子受体（EGFR）突变的测试（IVD）之间测试结果不准确的临床和经济影响。

使用决策分析模型来估计与IVD测定相比，LDTs错误分类的概率，我们估计在最佳情况下，2.3%的新诊断的转移性NSCLC患者会被LDTs错误分类，而IVD测定则为1%；与IVD测定相比，用LDTs测定的错误分类患者平均分别损失477和194个无进展寿命年。

与用IVD测定的患者相比，用LDTs测定的患者的总治疗费用高出约730万美元，原因是用靶向药或化疗治疗的患者的药物和不良事件费用更高。这些对社会造成的明显的临床和经济后果与所使用的技术无关，应促使临床医生和实验室人员利用已证明的准确性和临床确认的诊断测试，以最大限度地发挥个性化医疗的潜力。

在这方面，对基于DNA和蛋白质的测试之间产生冲突的结果（包括假阴性结果）的担忧，用于识别受益于新的突破性治疗方法的患者，不仅受到临床医生的关注，也受到FDA的关注。

因此，由于诊断技术和临床应用的复杂性不断增加，临床医生、实验室人员即（分子）病理学家和监管部门之间的合作对于改善临床药物选择和指导新的癌症基因疗法和分子靶向药的开发和批准至关重要。